氫氣對HaCaT角質形成細胞增殖及炎癥因子表達的影響

郭淑芬 吳嘉惠 劉伯言 陳文文 耿 彪 劉志超

山東第一醫科大學第二附屬醫院,泰安,271000

銀屑病是一種常見的免疫介導的以角質形成細胞過度增殖、異常分化及炎癥細胞浸潤為主要特征的慢性炎癥性皮膚病,全球發病率為0.1%～3%[1,2]。在銀屑病中,以T細胞為主的免疫細胞浸潤于皮膚局部,釋放白細胞介素(IL)-17A、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-23、IL-1β、IL-6等大量炎癥因子促進角質形成細胞過度增殖,而過度增殖的角質形成細胞進而釋放大量的細胞因子和趨化因子,以維持和放大炎癥反應[3-5]。因此,減弱角質形成細胞過度增殖或/和炎癥因子表達的策略被認為是銀屑病潛在的治療手段。

氫氣(H2)是一種無色、無味且具有還原性的氣體,其化學結構簡單,分子量小,易于擴散,容易進入機體各部位。大量研究已經證實氫氣對炎癥性疾病有調控作用,在大多數炎癥模型中,H2通過調節促炎細胞因子和抗炎細胞因子的水平來發揮抗炎作用[6,7,8]。我們前期探索性結果表明:氫氣干預治療斑塊狀銀屑病,PASI75及 PASI90 應答率較傳統治療明顯提高,肝腎功能未受影響,起到了良好的輔助治療作用。據此,我們提出以下假說:氫氣可能通過調控炎癥因子的表達,抑制角質形成細胞的增殖及異常分化,從而起到治療銀屑病的作用。

HaCaT細胞是人永生化角質形成細胞,為進一步探索氫氣作用于銀屑病的靶點及可能機制,本實驗以IL-17A、IL-22、腫瘤抑制素M、IL-1α和TNF-α的混合物M5[9]刺激HaCaT細胞,建立銀屑病角質形成細胞過度增殖及炎癥因子表達模型,探討氫氣對其影響,并與阿維A的作用進行對比分析,為氫氣治療銀屑病提供科學理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HaCaT細胞、HaCaT細胞專用培養基(MEM+15%FBS+1%P/S Solution)、胎牛血清購自武漢普諾賽生物科技有限公司,阿維A、胰蛋白酶-EDTA消化液購自北京索萊寶生物科技有限公司,IL-17A、IL-22、腫瘤抑制素M、IL-1α和TNF-α購自美國ProSpec公司,CCK-8試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司,TRIzol試劑、HiFiScript cDNA Synthesis Kit(cDNA合成試劑盒)和UltraSYBR Mixture(實時熒光定量試劑盒)購自北京世紀康為生物科技有限公司。SpectraMax i3x多功能熒光酶標儀來自美國Molecular Devices公司,QuantStudio3實時熒光定量PCR儀來自美國ThermoFisher公司,PH-A2氫氣細胞培養箱來自無錫恒緣生物醫藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細胞培養 HaCaT細胞培養于HaCaT細胞專用培養基中,置于飽和濕度、37℃、5% CO2培養箱內常規培養,取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 細胞培養結束后取出96孔板,CCK-8法檢測各孔吸光度:每孔更換新鮮培養基并加入10 μL CCK-8溶液,培養箱中反應3 h,酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度。

1.2.3 氫氣干預正常HaCaT細胞 將HaCaT細胞以15000個/mL接種至96孔培養板,每孔100 μL,置于37℃、5% CO2培養箱內培養24 h,后將細胞分別放入0%、25%、50%濃度氫氣培養箱(37℃、5% CO2)中培養72 h。培養結束后用CCK-8法檢測各孔吸光度。

1.2.4 M5誘導HaCaT細胞過度增殖 將HaCaT細胞以15000個/mL接種至96孔培養板,每孔100 μL,置于37℃、5% CO2培養箱內培養24 h待細胞貼壁。后將細胞培養液分別更換成含有0、2.5、5、10 ng/mL M5的細胞培養液,分別培養24、48、72 h。培養結束后用CCK-8法檢測各孔吸光度。

1.2.5 實驗分組處理 將HaCaT細胞以15000個/mL接種至96孔與6孔培養板(每孔分別為100 μL及3 mL),置于37℃、5% CO2培養箱內培養24 h。后將HaCaT細胞分為4組,Control組用含0 ng/mL M5的細胞培養液培養72 h,Model組用含2.5 ng/mL M5的細胞培養液培養72 h,H2組在Model組基礎上將細胞放入25%氫氣培養箱中培養72 h,Acitretin組在Model組基礎上加10 μmol/L阿維A培養72 h。

1.2.6 qRT-PCR檢測KRT6、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平 培養結束后取出6孔培養板,按照說明書使用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA,逆轉錄為cDNA,熒光定量,PCR儀檢測樣品的CT值(反應過程為95°C預變性10 min,95℃變性15 s,60℃延伸1 min,變性延伸共40個循環),GAPDH作為內參,2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列如下:

KRT6:5′-GGGTTTCAGTGCCAACTCAG-3′ (正向引物)

5′-CCAGGCCATACAGACTGCGG-3′ (反向引物)

IL-1β:5′-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3′ (正向引物)

5′-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA-3′ (反向引物)

IL-6:5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′ (正向引物)

5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′ (反向引物)

TNF-α:5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′ (正向引物)

5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′ (反向引物)

GAPDH:5′-CACATGGCCTCCAAGGAGTAA-3′ (正向引物)

5′-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3′ (反向引物)

2 結果

2.1 氫氣干預對正常HaCaT細胞增殖的影響 為了探究不同氫氣濃度干預是否影響正常HaCaT細胞,本實驗采用CCK-8法檢測了不同氫氣濃度(0%、25%、50%)干預72 h對正常HaCaT細胞增殖的影響。由圖1可知,與無氫氣相比,25%、50%濃度氫氣干預72 h后細胞吸光度相對值分別為(100.51±6.98)%、(103.04±5.22)%,各組之間無顯著差異,表明不同濃度氫氣對正常HaCaT細胞無明顯影響。本實驗選用25%氫氣濃度進行后續研究。

圖1 不同濃度氫氣干預72 h后HaCaT細胞增殖情況 圖2 不同濃度M5誘導不同時間后HaCaT細胞增殖情況(**:P<0.01) 圖3 不同干預方式對HaCaT細胞增殖的影響(**:vs Control,P<0.01;##:vs Model,P<0.01)

2.2 M5誘導HaCaT細胞過度增殖模型的建立 為了確定建立HaCaT細胞過度增殖模型的藥物濃度及時間,本實驗選用不同濃度M5(0、2.5、5、10 ng/mL)對HaCaT細胞進行24 h、48 h及72 h干預,并用CCK-8法檢測細胞增殖。由圖2可知,隨著時間的延長,各種細胞增殖活性逐漸提高。在第72 h,與正常生長的細胞相比(M5 0 ng/mL),2.5 ng/mL M5刺激下細胞增殖顯著提高(P<0.01),由此確定M5的造模濃度及時間為2.5 ng/mL刺激72 h。

2.3 氫氣干預對M5刺激的HaCaT細胞增殖的影響 由圖3可知,經過2.5 ng/mL的M5刺激72 h,細胞吸光度相對值顯著提高(Model vs Control,P<0.01),表明HaCaT細胞過度增殖。與Model組相比,25%氫氣干預可以顯著降低細胞吸光度相對值(P<0.01),抑制HaCaT細胞過度增殖。與Model組相比,陽性藥物阿維A干預的Acitretin組也顯著抑制了細胞增殖(P<0.01)。

2.4 氫氣干預對角質形成細胞過度增殖標記因子KRT6 mRNA表達的影響 KRT6被認為是角質形成細胞過度增殖的標記因子[10,11]。如圖4a所示,與Control組相比,Model組KRT6的mRNA表達顯著升高(P<0.001);與Model相比,25%的氫氣干預及陽性藥物阿維A干預對KRT6 的mRNA表達具有一定抑制作用(均P<0.001)。

圖4 不同干預方式對KRT6、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達水平的影響(*** :vs Control,P<0.001;##:vs Model,P<0.01;###:vs Model,P<0.001)

2.5 氫氣干預對炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達的影響 IL-1β、IL-6和TNF-α是促進銀屑病發生發展的炎癥因子[3-5]。與Control組相比,Model組炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達均顯著升高(均P<0.001);與Model組相比,25%氫氣干預對過度增殖的HaCaT細胞上述mRNA的表達均呈現出一定的抑制作用(P<0.01或P<0.001)。陽性對照藥物阿維A對相關炎癥因子的mRNA表達也起到顯著抑制作用(均P<0.01)。見圖4。

3 討論

銀屑病是一種由多種細胞介導的復雜炎癥性皮膚病,包括角質形成細胞、T細胞、內皮細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞[12]。角質形成細胞是皮膚的結構細胞,在銀屑病發病過程中既是參與者又是受害者。角質形成細胞增殖和凋亡之間的平衡是維持皮膚穩態的關鍵,銀屑病發病過程中,角質形成細胞凋亡減少,導致細胞過度增殖[13,14],過度增殖的角質形成細胞又會表達大量的細胞因子來維持和放大炎癥反應[3-5]。

IL-1是天然免疫和炎癥反應的重要介質,IL-1β具有促炎效應,放大炎癥級聯反應參與銀屑病的發生過程[15]。IL-6是調控多種細胞因子表達的重要誘導因子,參與了表皮和真皮細胞的生長和分化[16],IL-6異常升高將導致Treg細胞和Th17細胞之間的平衡紊亂,從而促進銀屑病的發生[17]。最新研究[18]發現,銀屑病患者血清IL-6濃度與患者的血沉、皮損面積及PASI指數正相關,且血清IL-6水平高的銀屑病患者更容易發生關節損害,可作為銀屑病炎性活動的指標。TNF-α在銀屑病的發病機制中處于關鍵地位,可作為銀屑病潛在的生物標志物和治療反應指標[19],針對TNF-α進行干預治療銀屑病被證明是有效的,是銀屑病靶向治療的重要策略[20]。因此,減輕角質形成細胞過度增殖或/和炎癥因子表達是治療銀屑病的熱點之一。

氫氣(H2)是一種安全、無毒的強抗氧化劑,具有選擇性抗炎、抗氧化作用。已有研究表明,H2可通過調控 NF-κB、MAPK 等信號通路,降低促炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23、干擾素-γ[21]等的釋放而發揮抗炎、抗氧化應激作用。而這些信號通路在銀屑病的發病中亦起著關鍵作用。近年來有關氫氣治療銀屑病的研究不斷報道。Zhu等報道,在氫水中洗澡可以顯著改善患者的銀屑病皮損[22]。另一項針對銀屑病相關關節炎和皮損患者的臨床研究也顯示,氫氣治療后炎癥減輕[23]。氫氣在各種損傷模型中可通過抑制炎癥因子(如L-1β、IL-6、TNF-α等),表現出抗炎活性[24]。因此,氫氣的使用可能成為一種新型的安全的皮膚疾病療法,改善銀屑病皮損,提高患者的生活質量。

本研究通過體外試驗初步發現,M5誘導72 h后HaCaT細胞增殖及KRT6、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 表達水平明顯升高;氫氣干預后上述指標顯著降低,表明氫氣能夠抑制銀屑病角質形成細胞模型過度增殖及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達。

綜上認為,氫氣可能是通過抑制銀屑病角質形成細胞的過度增殖及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達而發揮治療銀屑病的作用,但其具體機制及信號通路有待進一步探索。