EGFR shRNA聯合雷帕霉素對Colo-16細胞增殖、遷移及侵襲的影響

王 慧 楊 艷 李竹茜 展曉紅 魏志平

1青島市城陽區人民醫院皮膚科,青島,266109;2青島大學附屬醫院病理科,青島,266109;3徐州醫科大學附屬醫院皮膚科,徐州,221002

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)是一種以角質形成細胞過度增殖和分化水平的降低為特征的皮膚惡性腫瘤,其發病率僅次于基底細胞癌,惡性程度僅次于黑素瘤[1],目前,CSCC的治療主要有Mohs顯微外科、化療、光動力療法、放療、生物療法和免疫療法[2,3]。大多數皮膚鱗癌可通過手術成功根除,但部分皮膚鱗癌具有較高的侵襲性、轉移率和死亡率[3-6]。 EGFR/PI3K/AKT/mTOR是重要的信號通路之一,與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移密切相關[7-9]。EGFR 及mTOR通路在分子水平存在交叉點,均與CSCC發展密切相關[10,11]。雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是從吸水性鏈霉菌提取出來的一種新型大環內酯類免疫抑制劑,是mTOR特異性抑制劑[12,13],本研究以人CSCC細胞Colo-16為研究對象,觀察EGFR shRNA聯合RAPA對Colo-16細胞增殖、遷移和侵襲的影響,探討其可能機制,為CSCC的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 Colo-16細胞株由中國醫學科學院皮膚病研究所提供,胎牛血清來自杭州四季青生物材料有限公司,RPMI 1640培養液來自美國Gibco公司。陰性對照質粒shRNA-NC和EGFR shRNA質粒由上海吉瑪制藥有限公司構建,RAPA來自美國Sigma-Aldrich公司,細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自上海碧云天生物科技有限公司;Transwell購自美國Costar公司, Lipofectamine2000試劑來自美國Invitrogen公司,細胞增殖核抗原Ki-67(Ki-67)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9、鼠抗人 β 肌動蛋白一 抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗及Western印跡法化學發光工作液均來自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養及穩定細胞系構建 復蘇凍存的人皮膚鱗癌細胞系Colo-16細胞,接種于含10%胎牛血清和青鏈霉素的RPMI 1640培養基中,置37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中恒溫培養,按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書進行轉染,24 h后以1∶10傳代,細胞貼壁后加1200 μg/mL G418篩選,連續篩選6周,獲得穩定轉染EGFR shRNA質粒和shRNA-NC質粒的Colo-16細胞。取生長狀態良好的細胞進行后續研究,分為EGFRshRNA組(EGFR shRNA質粒轉染Colo-16細胞)和陰性對照組(shRNA-NC轉染Colo-16細胞),用于后續研究。

1.3 CCK-8增殖實驗 將常規培養的Colo-16細胞、轉染shRNA-NC的Colo-16細胞、轉染EGFR shRNA的Colo-16細胞以1×103個/孔接種于96孔板,培養12 h后加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)或終濃度200 nmol/L的RAPA[14],實驗分為5組,即正常細胞組(常規培養的Colo-16+PBS)、陰性對照組(轉染shRNA-NC質粒的Colo-16細胞+PBS)、EGFR shRNA組(轉染EGFR shRNA質粒的Colo-16細胞+PBS)、RAPA組(常規培養的Colo-16細胞+RAPA)、聯合組(轉染EGFR shRNA質粒的Colo-16細胞+RAPA)。將各組Colo-16細胞接種至96孔板中,每孔0.4×104個細胞,分別培養24、48、72、96 h。避光條件下每孔加入CCK-8溶液20 μL,置培養箱中繼續培養4 h,酶標儀測定各孔波長450 nm處的吸光度(A)值,代表細胞增殖活性,實驗重復3次,繪制細胞生長曲線。

1.4 克隆形成實驗 各組Colo-16細胞采用胰酶消化,制備單細胞懸液,倍數稀釋,接種6孔板,以每孔500個細胞分別培養,培養至形成肉眼可見的集落,終止生長,用PBS洗滌培養基,4%多聚甲醛固定15 min,1%結晶紫染液染色10 min,顯微鏡觀察拍照,計算細胞大于10個的克隆數,計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/細胞數×100%,實驗重復3次。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將各組Colo-16細胞密度調整為2×105/mL,接種于6孔板,待細胞完全生長融合后,用無菌槍頭均勻劃過,產生距離相等的劃痕,此時劃痕距離為0 h劃痕寬度。用PBS洗滌細胞,去除未貼壁細胞,然后加入培養基以及藥物對細胞處理24 h。此時細胞劃痕距離為24 h劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

1.6 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 正常細胞組、陰性對照組、RAPA組、EGFR shRNA組和聯合組細胞培養至指數生長期,采用胰酶消化制備單細胞懸液,密度調整為2×105/mL,分別接種于含基質膠的Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基,在細胞培養箱繼續培養24 h,擦去上層細胞,4%多聚甲醛固定,1%結晶紫染色液染色,于倒置相差顯微鏡下隨機選擇3個視野,計數下室染色細胞。實驗重復3次。

1.7 免疫蛋白印跡法(Western blot) 收集各組細胞,預冷PBS洗滌2次,用RIPA裂解液提取細胞總蛋白,10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜,5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗體配比濃度:Ki-67(1∶500)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)和β-actin(1∶1 000),4℃孵育過夜,TBS洗滌3次,每次20 min,洗膜后分別放入用TBS 稀釋的二抗(1∶3000)1 h,PBS洗滌3次后,發光液顯影,使用Image J分析軟件計算條帶灰度值,目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β肌動蛋白蛋白條帶灰度值,實驗重復3次。

1.8 半定量RT-PCR檢測 用Trizol法提取細胞總RNA,紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度,然后反轉錄為cDNA。利用Premier 5.0設計引物,MMP-2正向引物序列:5′-GAACACCAGAGGAAGCCGTCAC-3′,反向引物序列:5′-AGCTGTGGACTCTAGGAGAAGGAC-3′;MMP-9正向引物序列:5'-TGGTGCAGGCAGAGTAGGAGTG-3',反向引物序列:5'-CTACACGGAGCATGGCAACGG-3';Ki-67正向引物序列:5'--GGGAAAGTAGGTGTGAAAGAAGAG-3',反向引物序列:5'--ATCTGCTTTGGAGACTCCTTA-3';內參β肌動蛋白正向引物序列:5′-GAACGGTGAAGGTGACAG-3′,反向引物序列:5′-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3′。PCR擴增參數:94℃預變性5 min;94℃變性40 s,60℃退火30 s,72℃延伸45 s,擴增40個循環。用Image J圖像分析軟件分析PCR產物的灰度值,實驗重復3次。

2 結果

2.1 EGFR shRNA聯合雷帕霉素對Colo-16細胞增殖活性的影響 CCK-8實驗及克隆形成實驗顯示,EGFR shRNA組、RAPA組及聯合組Colo-16細胞吸光度A值及細胞克隆形成率均顯著低于正常細胞組及陰性對照組,吸光度A值為(0.34±0.004,0.51±0.013,0.26±0.006比0.67±0.002,0.66±0.028),克隆形成率為[(70.27±3.74)%,(78.75±3.26)%,(52.87±4.89)%比(89.48±3.74)%,(88.46±4.59)%],差異有統計學意義(F=368.91、27.49,均P<0.05)。其中,聯合組細胞增殖活性最低,顯著低于EGFR shRNA組和RAPA組(CCK-8:q值分別為8.00、 24.40;克隆形成率:q值分別為6.03、 8.98,均P<0.05),而正常細胞組與陰性對照組細胞增殖活性差異無統計學意義(P>0.05)(圖1,2)。

圖1 EGFR shRNA聯合RAPA對Colo-16細胞增殖活性的影響

2a:正常細胞組;2b:陰性對照組;2c:EGFR shRNA組;2d:RAPA組;2e:聯合組圖2 EGFR shRNA聯合RAPA對Colo-16細胞克隆形成的影響

2.2 EGFR shRNA聯合雷帕霉素對細胞遷移和侵襲能力的影響 與正常細胞組、陰性對照組比較,EGFRshRNA組、RAPA組和聯合組劃痕愈合率及侵襲細胞個數表達均顯著降低(均P<0.05)。其中,聯合組細胞劃痕愈合率及侵襲細胞個數顯著低于EGFRshRNA組、RAPA組(劃痕愈合率:q值分別為11.73、21.66,均P<0.05);侵襲細胞數目:q值分別為8.40、9.79,均P<0.05),正常細胞組與陰性對照組相比上述各蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)(圖3、4,表1)。

表1 EGFR shRNA、雷帕霉素單獨及聯合處理對Colo-16細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數的影響

3a、3f:正常細胞組;3b、3g:陰性對照組;3c、3h:EGFR shRNA組;3d、3i:RAPA組;3e、3j:聯合組圖3 EGFR shRNA聯合RAPA對Colo-16細胞遷移能力的影響

4a:正常細胞組;4b:陰性對照組;4c:EGFR shRNA組;4d:RAPA組;4e:聯合組圖4 EGFR shRNA聯合RAPA對Colo-16細胞侵襲能力的影響

2.3 EGFR shRNA聯合雷帕霉素對增殖、侵襲相關蛋白的影響 與正常細胞組、陰性對照組比較,雷帕霉素組、EGFR shRNA組和聯合組增殖及侵襲相關蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表達均明顯下降,且聯合組上述蛋白表達的下降最顯著,均P<0.05,正常細胞組與陰性對照組相比上述各蛋白表達差異無統計學意義(均P>0.05)(圖5)。

5a、5c:a:與正常細胞組相比;b:與EGFRshRNA組相比;c:與RAPA組相比,均P<0.05。5b:1:正常細胞組;2:陰性對照組;3:EGFR shRNA組;4:RAPA組;5:聯合組;圖5 EGFR shRNA聯合RAPA對Colo-16細胞增殖及侵襲相關蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達的影響

3 討論

CSCC是常見的皮膚非黑素細胞惡性腫瘤,呈侵襲性生長,病情進展快,具有較強的浸潤侵襲能力,轉移和復發一直是CSCC患者死亡的主要原因[15]。EGFR在皮膚鱗癌細胞分化、增殖、凋亡以及細胞應激反應中起著關鍵作用,其過表達與不良預后密切相關[16]。EGFR/PI3K/AKT/mTOR信號通路是多種腫瘤細胞信號轉導的常見通路, 參與調控惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等過程,也是藥物干預惡性腫瘤的潛在靶點[17-19]。由于腫瘤是多基因、多環節致病,單一基因療法往往療效欠佳, 多基因聯合治療抑癌作用較單基因治療顯著[20]。特異性靶向治療聯合化療藥物是當前腫瘤綜合治療的熱點,由于抑制mTOR會引起負反饋機制,激活上游分子,進一步活化EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路,對EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路的雙重抑制或許能夠有效避免負反饋機制,更有效增強抗腫瘤作用,可能為晚期CSCC提供新的治療思路。

失控性增殖是惡性腫瘤的基本特征。細胞增殖核抗原(Ki-67)是一種增殖細胞相關抗原,是反映細胞增殖活性的敏感指標,在多種惡性腫瘤中過表達,能夠較好地反映腫瘤的生長增殖特性[21,22],前期研究發現EGFR shRNA聯合RAPA增強EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路下游凋亡相關蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase9的表達均顯著增加,抑制增殖相關蛋白cyclin D1、p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表達,針對這一通路的雙重抑制有協同增效的作用[23]。本研究中,我們針對EGFR基因設計干擾質粒EGFR shRNA,針對mTOR基因應用其特異性抑制劑RAPA,探討EGFRshRNA聯合RAPA對皮膚鱗癌Colo-16細胞增殖、遷移和侵襲的影響,并對其可能機制進行初步探究。 CCK-8實驗、克隆形成實驗及Western blot 顯示,EGFR shRNA組、RAPA組及聯合組Colo-16細胞吸光度A值、細胞克隆形成率及Ki-67蛋白表達水平均顯著低于正常細胞組及陰性對照組,其中,聯合作用優于EGFR shRNA或雷帕霉素單獨處理。

MMP-2和MMP-9是目前發現的與腫瘤轉移關系最密切的基質金屬蛋白酶家族成員,表達升高后可以誘導腫瘤轉移,其表達水平與細胞遷移、侵襲呈正相關[24,25]。劃痕實驗及Transwell小室實驗結果顯示:與正常細胞組比較,EGFRshRNA組、RAPA組和聯合組劃痕愈合率、侵襲細胞數目及MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低(均P<0.05),其中,聯合組顯著低于EGFRshRNA組、RAPA組 。

綜上所述,本研究結果初步表明,靶向EGFRshRNA聯合化療藥物雷帕霉素在抑制CSCC細胞Colo-16的增殖、遷移和侵襲方面具有協同增效作用,推測其機制可能與雙重抑制EGFR/PI3K/AKT/mTOR通路有關。這一結果證明靶向基因治療和化療藥物聯合治療方法的可行性,為CSCC的治療提供新思路,但由于本研究聯合用藥的結果僅基于體外細胞實驗,聯合用藥的療效還有待動物和臨床試驗的進一步研究和驗證。