芍藥甘草湯對大鼠酒精性胃潰瘍的保護作用及其可能機制研究*

上海市徐匯區中心醫院

楊黎娜 王 君△ 王 爽△△(上海 200030)

提要 目的：本研究旨在評估芍藥甘草湯(SGD)對大鼠酒精性胃潰瘍(GU)的保護作用及其可能機制，以期為臨床治療提供參考。方法：采用單次灌胃10 mL/kg 75%乙醇建立大鼠胃潰瘍模型，對胃組織進行組織病理學檢查。用雙抗體夾心法測定胃組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)、前列腺素E2(PGE2)、超氧化物歧化酶(SOD)和血漿硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)水平。應用網絡藥理學研究方法，進一步研究SGD治療GU的可能機制。結果：組織學特征顯示，酒精性GU大鼠的胃組織在整個胃黏膜層均有明顯的損傷，而SGD治療組大鼠的胃黏膜損傷明顯減輕。標志物檢測顯示，SGD(9.90 g/kg)組和SGD(19.80 g/kg)組TNF-α的水平顯著下降(分別為模型組的87.17%和86.50%，P<0.01)。SGD(9.90 g/kg)組和SGD (19.80 g/kg)組PGE2水平均顯著高于模型組(分別為模型組的172.40%和220.86%，P<0.01)。與模型組比較，SGD(19.80 g/kg)組SOD水平均顯著升高(為模型組的162.13%，P<0.01)。而在脂質過氧化方面，SGD(9.90 g/kg)組、SGD(19.80 g/kg)組TBARS水平顯著下降(分別為模型組的78.66%、71.83%，P<0.01)。結論：SGD對乙醇所致GU有改善作用。此外，本研究還揭示了SGD治療GU的多組分、多靶點、多途徑的特點，為進一步的藥物開發研究提供了基礎。

胃潰瘍(GU)是影響消化系統的最常見疾病之一，具有高發病率、高復發率和高癌變率。用于治療GU的常規藥物包括質子泵抑制劑、抗酸劑、H2受體拮抗劑和抗膽堿能藥物[1]。然而，目前的治療方法的療效并不是絕對的，它們可能有嚴重的副作用，如胃腸道反應、反彈反應、高胃泌素血癥、肝腎毒性、過敏和心律失常[2]。因此，許多學者開始尋找具有治療作用的天然產物或天然資源，以取代副作用較強的藥物[3]。

芍藥甘草湯(SGD)是中醫的經典方劑，自漢代張仲景的《傷寒論》記載以來，一直沿用至今[2]。SGD由白芍和甘草按1∶1比例配伍而成，具有雙向調節、解痙攣、止痛等藥理作用，對多種疾病均有較好的療效[4]。芍藥為君藥，味酸、微甘，性微寒，可養血調經、斂陰柔肝止痛，既能滋肝陰而養肝血，又能夠斂肝陰而柔肝體，可發揮鎮痛、抗炎及護肝等藥理作用。芍藥有效成分芍藥苷，既可減輕炎性反應，緩解炎性疼痛，又可減輕神經性疼痛。甘草為臣藥，具有補虛、緩急止痛之功效。現代藥理研究表明甘草中的甘草總黃酮可以與芍藥總苷協同作用，緩解神經性疼痛，臨床上主要用于治療以內臟平滑肌絞痛和嚴重痙攣為特征的疾病，如GU和十二指腸潰瘍[5]。但是，至今尚未有研究闡明SGD對GU的胃保護作用的相關機制。因而本研究通過組織病理學評價系統，研究了SGD對大鼠酒精性GU的保護作用，并進一步研究炎性細胞因子的釋放、胃黏膜保護性介質的產生和氧化應激狀態。

1 材料與方法

1.1 材料準備 本研究使用為SPF級雄性SD大鼠(6～8周齡，實驗動物倫理號IACUC-20190101-01)，體質量(220±20)g，實驗動物均在SPF實驗動物中心飼養，飼養環境為(25±2)℃，相對濕度40%～60%。實驗前禁食12 h，禁水3 h，動物實驗經醫院動物倫理委員會批準(倫理號：2022014)。SGD由白芍和甘草(批號：20020101，200316，購自國藥同濟堂貴州藥業有限公司)按1∶1的比例組成。2種中草藥(110 g)按1∶8的比例在冷水中浸泡0.5 h，在強熱下煮沸后，在慢火下加熱1 h，然后過濾。殘渣用8倍量冷水煮沸1 h，再次過濾。將濾液組合并濃縮干燥。以原干粉為原料，在使用前加入適量的超純水，并以1 g/mL的最終濃度將其超聲制成懸浮液。

1.2 SGD誘導治療GU 所有大鼠(48只)隨機分為6組(n=8)：對照組(CON)、模型組(MOD)、陽性對照組(硫糖鋁)、SGD-L、M、H(4.95、9.90、19.80 g/kg)組。根據原料計算SGD的劑量，根據人-動物劑量換算公式按人劑量給動物給藥。麻醉藥物和劑量：戊巴比妥購自上海卓凱生物科技有限公司，批號ZC-36981。所有大鼠采用腹腔麻醉，劑量麻藥：體質量=1∶100。大鼠在上午9 時灌胃給藥1次。7 d后，對照組、模型組大鼠灌胃生理鹽水(10 mL/kg)，陽性對照組灌胃硫糖鋁0.36 g/kg(上海阿拉丁生物試劑有限公司，批號為：2020107724)，SGD-L、M、H組分別灌胃4.95、9.9、19.8 g/kg，每日1次。第6 d給藥后，禁食12 h，隨意飲水。第7 d給藥前，斷水3 h，按上述方法給藥。造模方法為除對照組外，其余大鼠均于末次給藥后1 h灌胃75%乙醇10 mL/kg[4-5]，造模成功如圖1所示。對照組大鼠灌胃生理鹽水10 mL/kg、其余5組大鼠75%乙醇灌胃，1 h后，麻醉下頸椎脫位處死大鼠，取胃，固定在福爾馬林中，進行組織學分析。

圖1 空白對照組大鼠胃(a)與模型組大鼠胃(b)

1.3 觀察方法 固定組織脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木精-伊紅染色鏡檢。用數字切片掃描儀觀察和拍攝圖像，并觀察特定的病變。將胃組織從冷凍箱(-80 ℃)中取出，解凍。在冰浴條件下，切割切片，加入9倍體積(約100 mL)的預冷PBS溶液，使用電動組織均質器將切片均質。勻漿在4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，離心后收集上清液進行測定。所有步驟均嚴格按照試劑盒說明執行。最后，使用多功能微板讀取器測量每個井在特定波長的吸光度。根據標準曲線測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)、前列腺素E2(PGE2)、超氧化物歧化酶(SOD)和血漿硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)水平(上述Elisa試劑盒均購買自上海阿拉丁生化科技有限公司，批號依次為：20222400789，CS-E10005，363-24-6，19160-1KT-F，104821-25-2)。

2 結果

2.1 組織學特征 具體如圖2所示，HE染色結果顯示，胃黏膜上皮細胞完整，炎性細胞正常，未見浸潤、充血、水腫。與對照組比較，模型組大鼠胃黏膜全層損傷更明顯，黏膜上皮和固有層壞死，黏膜上皮缺失，固有層管狀胃腺形態結構模糊，大量壁細胞和主細胞壞死，胞核溶解。細胞質溶解或缺失，表明75%乙醇對大鼠胃黏膜造成嚴重損傷。與模型組比較，SGD-L(4.95 g/kg)組大鼠胃組織損傷程度無明顯減輕。SGD-M(9.90 g/kg)組大鼠胃組織淺表黏膜損傷較輕，黏膜下層、肌層和外膜相對完整，具有明顯的層次性。黏膜下層可見不同程度的炎性細胞浸潤。陽性模型組損傷程度與SGD-M(9.90 g/kg)組相似。SGD-H(19.80 g/kg)組損傷程度最小，胃組織黏膜層、黏膜下層、肌層、外膜結構較完整、層次化，黏膜下層未見明顯水腫，炎細胞輕度浸潤。

圖2 SGD對模型大鼠胃黏膜病理形態的影響 (×100)

2.2 SGD對各標志物產生的影響 具體如圖3所示。如圖3a所示，與對照組相比，模型組胃組織中TNF-α水平升高(變化1.17倍)，引發炎癥反應。但與模型組比較，陽性模型組和SGD(4.95 g/kg)組TNF-α水平降低(模型組分別為85.83%和88.87%，P<0.05)。SGD(9.90 g/kg)組和SGD(19.8 g/kg)組TNF-α的水平顯著降低(分別為模型組的87.17%和86.50%，P<0.01)。研究結果表明，SGD可降低GU大鼠胃組織TNF-α的表達水平，減輕炎癥，保護胃黏膜。

注：a.TNF-α；b. EGF；c.PGE2；d.SOD；e.TBARS。數值為8個樣本的平均值±標準差。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖3 SGD對模型大鼠胃組織TNF-α、EGF、PGE2、SOD、TBARS水平的影響

圖3b和圖3c顯示了SGD對GU大鼠胃組織中EGF和PGE2水平的影響。統計分析顯示，與對照組相比，模型組胃組織中EGF和PGE2水平顯著降低(EGF變化1.28倍，PGE2變化2.49倍，P<0.01)。與模型組比較，陽性模型組、SGD(9.90 g/kg)組、SGD(19.80 g/kg)組EGF水平均顯著升高(分別為模型組的123.53 %、118.45 %、125.90 %，P<0.01)。同樣，陽性模型組、SGD(9.90 g/kg)組和SGD(19.80 g/kg)組PGE2水平均顯著高于模型組(分別為模型組的174.15 %、172.40 %和220.86 %，P<0.01)。研究結果提示，SGD可增加GU大鼠胃組織中EGF和PGE2的表達，提高胃黏膜屏障的保護功能。

如圖3d所示，乙醇誘導的胃損傷是由活性氧(ROS)的增加介導的。對ROS的防御機制主要體現在增加內源性抗氧化酶水平和抑制脂質過氧化。在抗氧化酶方面，模型組胃組織SOD水平明顯低于對照組(變化1.69倍)。與模型組比較，陽性模型組和SGD(19.80 g/kg)組SOD水平均顯著升高(分別為模型組的149.78 %和162.13 %，P<0.01)。SGD(9.90 g/kg)組 SOD的水平升高(是模型組的129.16 %，P<0.05)。

如圖3e所示，在脂質過氧化方面，模型組大鼠胃組織中硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)水平明顯高于對照組(1.37倍變化，P<0.01)。與模型組比較，陽性模型組、SGD(9.90 g/kg)組、SGD(19.80 g/kg)組TBARS水平顯著降低(分別為模型組的77.10 %、78.66 %、71.83 %，P<0.01)。研究結果提示，SGD可有效提高大鼠胃組織中SOD的表達水平，降低大鼠胃組織中TBARS的表達水平，減輕氧化應激損傷，從而保護胃黏膜。

3 討論

芍藥甘草湯(SGD)作為《古代經典名方目錄(第一批)》中的100個經典方劑之一，方劑簡練，配伍清晰，療效準確，臨床用藥記錄豐富，具有極其重要的研發價值[6]。本研究采用75%乙醇建立大鼠酒精性GU模型，從抗炎、胃黏膜保護、抗氧化3個方面驗證SGD的抗GU作用[7]。炎癥是GU發病機制中的一個重要方面，多種炎癥細胞因子參與其中。TNF-α主要是由肥大細胞、血管內皮細胞和單核巨噬細胞分泌的一種具有廣泛生物學活性的效應分子。它能有效地促進中性粒細胞的滲透。因子可激活中性粒細胞大量聚集在潰瘍周圍，阻礙潰瘍周圍的血液微循環，引起胃微循環障礙，誘發潰瘍形成[8]。在本研究中，正常大鼠灌胃75%乙醇后，胃組織中TNF-α的水平升高，給藥能降低GU大鼠胃組織中TNF-α的表達水平，減輕炎癥反應。筆者的研究結果與前人的研究結果一致[7-8]，表明SGD的抗炎活性在一定程度上具有胃保護作用。

EGF和PGE2是胃黏膜重要的防御和修復因子。EGF可以抑制胃酸和胃酶的分泌，減少對黏膜的損傷，增加胃黏膜和糖蛋白的合成和分泌，調節其對胃黏膜的營養和保護作用，維護胃黏膜的完整性[9]。PGE2可增加胃黏膜局部血流量，刺激胃黏膜基底細胞向表面遷移，促進黏膜修復，維持黏膜完整性，增強黏膜防御功能[10]。在本研究中，給予SGD后，EGF和PGE2的水平顯著升高。筆者的結果與許多以前的研究結果是一致的[9-10]，提示SGD可促進胃黏膜合成、分泌和釋放PGE2，增加內源性EGF水平，從而促進胃黏膜的生長。損傷修復，增強胃黏膜屏障防御功能。

氧化應激是指生物體或細胞內氧自由基的產生和清除之間的失衡，導致體內或細胞內活性氧物種(ROS)的積累，進而引起氧化[11]。SOD是一種重要的細胞內抗氧化酶，是抵御ROS的第一道防線。它催化超氧自由基轉化為更穩定的過氧化氫，然后在體內被過氧化氫酶分解成完全無害的水，保護細胞免受ROS的毒性損害[12]。過量的活性氧會導致脂質、蛋白質、核酸和其他細胞成分發生脂質過氧化，從而導致功能障礙，增加TBARS的水平，并嚴重損害胃組織的表面。SOD過程在黏膜損傷的發病機制中起著關鍵作用[13]。在本研究中，正常大鼠灌胃75 %乙醇后，胃組織中的SOD水平顯著降低，而TBARS水平顯著升高。SGD能有效提高大鼠胃組織中SOD的表達水平，降低大鼠胃組織中TBARS的表達水平。研究結果表明，SGD可以減輕氧化應激損傷，從而保護胃黏膜。胃黏膜上皮細胞的凋亡與潰瘍的發生密切相關。胃黏膜上皮細胞具有持續更新的能力，即損傷后具有一定的修復功能[14]。正常情況下，胃黏膜上皮細胞處于凋亡與增殖之間的平衡狀態。然而，當胃黏膜受到嚴重破壞時，就會破壞胃上皮的結構和功能細胞，打破其增殖和凋亡的平衡，引起GU[15]。

綜上所述，SGD對大鼠胃黏膜有保護作用，對酒精性GU損傷有保護作用，并能促進潰瘍愈合。SGD的保護作用至少部分通過抗炎作用、EGF產生、PGE2產生和抗氧化應激作用來解釋。當然，SGD抗胃潰瘍的潛在機制有待進一步驗證，需要更清晰的作用機制和動力學基礎，為SGD的臨床應用提供更科學可靠的實驗數據支持。