優化脂肪間充質干細胞外泌體提取方法的研究*

韓 悅,耿承奎,張鑫瑞,雷 蕾,劉建宇

(1.云南中醫藥大學,云南 昆明 650000;2.昆明醫科大學附屬醫院延安醫院骨科,云南 昆明 650000)

來源廣泛,取材方便、不涉及免疫排斥和倫理學問題等顯著優勢,使脂肪間充質干細胞(adipose-derived stromal cell,ADSCs)逐漸在近幾年的再生醫學領域研究中脫穎而出[1]。但其細胞移植到體內的存活率低嚴重限制了間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)的修復潛能,且儲存條件較苛刻,運輸不便,臨床應用較困難[2]。外泌體是由雙層磷脂分子層包圍,呈現典型茶杯狀結構的囊泡。外泌體內部含有四跨膜蛋白家族(CD63,CD81 和CD9)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)等多種蛋白[3]及一些核酸以及脂質分子[4]。外泌體相比間充質干細胞,具有更加穩定、安全、低免疫原性的優點,且更便于運輸和儲存[5],因此外泌體成為了以MSC為基礎,更卓越的新選擇[6]。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

100KD 超濾管(millipore);外泌體提取試劑盒(invitrogen);間充質干細胞胎牛血清、無外泌體胎牛血清,DMEM/F12培養基(vivacell,原BI);兔抗鼠TSG101、CD9 抗體(Proteintech)

1.2 實驗方法

1.2.1 分離提取與培養大鼠原代ADSCs

1.2.1.1 大鼠原代ADSCs的分離提取

組織塊貼壁法:(1)選擇 3～4 周齡的雌性大鼠(Sprague-Dawley,SD),將其兩側腹股溝下脂肪組織分離下來。(2)放入裝有磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)的離心管里,用含雙抗的 1*PBS充分沖洗脂肪組織 3～4 次[7]。(3)將組織剪成1*1*1 mm大小后均勻分布在培養皿中。(4)在超凈臺里放置 15～20min干燥脂肪塊,緩慢滴加10mL完全培養基后置于 37℃,5% CO2培養箱,每天觀察脂肪貼塊周圍細胞爬出情況和細胞形態。培養 48 h 后換液,去除懸浮細胞,所得細胞即為原代ADSCs。

1.2.1.2 ADSCs的培養

將P3～6 代的ADSCs在T75的培養瓶中進行培養,2d進行一次換液。用完全培養基(體積分數為 10% 間充質干細胞FBS +1% 雙抗溶液 + DMEM/F12 培養基)培養增殖至85%～90%匯合時,改加入不含外泌體的間充質干細胞培養基(體積分數為 10% 不含外泌體的間充質干細胞FBS +1%雙抗溶液 + DMEM/F12 培養基),繼續培養48h[8],48h后收集細胞上清,將其分裝放置于 50mL 離心管中,并于-80℃的溫度下保存備用。

1.2.2 外泌體的提取

用 100kDa 的超濾管對收集的細胞上清進行濃縮,以2000*g離心濃縮過的細胞上清30min,以去除細胞和碎片,加入50%細胞培養基體積的總外泌體分離試劑,混合均勻后于4℃冰箱孵育過夜,以 4℃,10000*g 離心1h后,用200μL 1*PBS重懸管壁的沉淀物,將所得的外泌體懸液放在-80℃的溫度下保存備用。

1.2.3 外泌體的鑒定

1.2.3.1 透射電鏡觀察外泌體大體形貌

取上述20uL外泌體懸液,滴于載樣銅網上,保留2min后用磷鎢酸溶液負染固定 5min,用濾紙吸干液體后自然干燥,觀察外泌體形貌、尺寸,并將其拍攝下來。

1.2.3.2 粒度儀檢測粒徑尺寸及濃度

樣本池用去離子水清洗;取樣本以1*PBS buffer稀釋,進樣檢測。

1.2.3.3 蛋白質印跡法檢測外泌體膜蛋白CD9、TSG101表達

對外泌體懸液進行裂解,收集的蛋白質樣品在 10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳,溴酚藍到達膠的底端后將電泳的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜(PolyVinylideneFluoride,PDVF)上(300mA,60min),并在室溫下用 5% 脫脂奶粉封閉,加入CD9、TSG101一抗在 4 ℃搖床孵育過夜,洗滌印跡,回收一抗后在室溫下與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育 1 h,于顯影儀檢測蛋白表達。

1.2.3.4 BCA蛋白濃度檢測法(bicinchoninic acid,BCA)測蛋白含量

將外泌體懸液于冰上裂解30min后,按 BCA 試劑盒說明書詳細步驟測定外泌體懸液的蛋白濃度。樣本品孔加入5μL外泌體懸液,重復兩個復孔,蛋白稀釋液定容至20μL,加入 BCA 工作液于37 ℃培養箱孵育30 min,用酶標儀測定各孔在 562 nm 處吸光度值,繪制標準曲線代入R2公式測算出外泌體懸液的蛋白濃度。

2 結果

2.1 大鼠ADSCs形態學

從第2d起可觀察到從脂肪組織塊周圍陸續有細胞爬出貼壁,主要以長梭形為主,有一些為多角形,細胞生長狀態旺盛時,呈旋渦狀、魚群狀,見圖1。

圖1 大鼠ADSCs在倒置顯微鏡下的形態注:圖A為大鼠原代ADSCs培養3 D的狀態,見少量細胞逐漸從組織塊周圍爬出,呈梭形;圖B為大鼠原代ADSCs培養7D的狀態,可見大量細胞從組織塊爬出;圖C為第3代大鼠ADSCs。

2.2 外泌體表征

2.2.1 大鼠脂肪間充質干細胞源性外泌體的形態學特征

提取的外泌體在透射電鏡觀察下呈典型的茶杯型結構。可見外泌體是具有雙層膜包繞的囊泡結構,中央為低電子密度成分,分布較集中且邊界清晰,直徑約為100nm左右,見圖 2。

圖2 提取外泌體在透射電鏡下的形態學特征

2.2.2 粒度儀檢測粒徑分布峰值、大小、濃度

外泌體粒徑分布峰值為 112.2nm,濃度為7.5×1011 粒子/mL,外泌體平均直徑在70～140nm之間,見圖 3。

圖3 粒度儀測定提取外泌體粒徑分布

2.2.3 Western blot檢測結果

ADSCs來源外泌體表面標記蛋白CD9(+)TSG101(+),見圖 4。

圖4 蛋白質印跡法分析外泌體表面標記蛋白:CD9(+),TSG101(+),為外泌體典型特征

2.2.4 1000mL大鼠ADSCs的細胞上清濃縮后,與外泌體提取試劑盒共同孵育離心,用200μL的1*PBS重懸形成的外泌體懸液經BCA法測定濃度為7.66mg/mL,見圖5。

圖5 BCA法測定蛋白含量

3 討論

目前很多方法可以提取外泌體,包括超濾法、密度梯度離心、尺寸排除色譜法、聚合物沉淀法等。超濾法被稱為分離提取外泌體的“金標準”,但其費時費力,需要用到昂貴的超速離心機,過度超離還會導致外泌體破裂;密度梯度離心法是由超離法改良升級的[9],同時也存在著花費時間長、操作繁瑣、技術要求高、得率低、需要昂貴的超速離心機等問題;聚合物沉淀法純度極低,雜蛋白多,外泌體易受到脂蛋白或病毒顆粒的污染,可能對隨后的分析(例如蛋白質組學)產生不利影響;尺寸排除色譜法需要昂貴的色譜儀器、不適合大體積樣本。

隨著外泌體相關研究的逐漸火熱,一些公司針對以上方法的缺陷研制了簡單快速提取外泌體的試劑盒,大多數可以大大提高完整外泌體的回收率,靈活性極佳。但外泌體提取試劑盒一般量少(50mL左右),且價格昂貴。對外泌體提取需求量大且沒有超速離心機等昂貴設備的研究者可以選擇先將細胞上清用100KD的超濾管濃縮后,再使用外泌體提取試劑盒,這種方法可以大大節省外泌體提取試劑盒的用量,節約成本,經濟劃算且效率高。但目前商用提取試劑盒的應用仍存在很多挑戰[10],如不同廠家性能不一,提取純度不一,所提質量無法保證,尚缺乏能夠同時實現高通量、高純度、高回收率和高性價比的外泌體分離方法。本研究使用外泌體提取試劑盒的優化方法提取大鼠脂肪間充質干細胞源性外泌體,旨在為后續外泌體在實驗研究及臨床應用上尋找出一條簡便高效提取外泌體的途徑,奠定技術基礎。