乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取蝦殼中蝦青素研究

馮金華 何梓淵 劉紅英 李麗娜

摘要 ?采用乙醇-硫酸銨雙水相制備蝦殼中的蝦青素，探索蝦殼中蝦青素提取的條件。結果表明：采用乙醇溶液，料液比1 ∶15，每次提取3 h，提取2次，提取效果較好。采用乙醇-硫酸銨雙水相萃取蝦青素，蝦青素主要集中在上下兩相之間，最佳條件：20%硫酸銨∶蝦青素乙醇提取液（v/v）=2.5 ∶2.0，沉淀率為89.09%。經薄層色譜法和高效液相色譜法檢測，雙水相萃取可使蝦青素提取液中的各類型蝦青素都沉淀。

關鍵詞 ?蝦青素；雙水相體系；分離

中圖分類號 ?TS 254.9 ??文獻標識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0176-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.040

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Extraction of Astaxanthin from Shrimp Shells by Ethanol /（NH4）2SO4 Aqueous Two-phase System

FENG Jin-hua， HE Zi-yuan， LIU Hong-ying et al

（Hebei Agriculture University， Qinhuangdao， Hebei 066003）

Abstract ?Astaxanthin in shrimp shell was prepared by ethanol/（NH4）2SO4 aqueous two-phase method. The extraction conditions of astaxanthin from shrimp shell were explored. It was determined that ethanol solution was used， the solid-liquid ratio was 1 ∶15， extracted for 3h and twice， and the extraction effect was better. Astaxanthin was extracted by ethanol/（NH4）2SO4 aqueous two-phase extraction. Astaxanthin was mainly concentrated between the upper and lower phases. The optimum condition was that 20% （NH4）2SO4 ∶ astaxanthin ethanol extract（v/v） = 2.5 ∶2.0， and the precipitation rate was 89.09%. By TLC and HPLC examination， all kinds of astaxanthin in astaxanthin extract can be precipitated by aqueous two-phase extraction. This environmentally friendly method has potential application prospects in the large-scale separation of astaxanthin.

Key words ?Astaxanthin;Aqueous two-phase system;Separation

蝦青素又稱變胞藻黃素，英文習慣命名為Astaxanthin，全反式蝦青素的中文系統命名為全反式3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′胡蘿卜素，相對分子質量為596.86，純蝦青素是暗紅紫色粉末，熔點224 ℃，不溶于水，能溶解于大多數有機溶劑［1］。蝦青素天然產物多數以酯的形式存在，有些是一元酯，有些是二元酯，存在于自然界中的大部分蝦青素及其酯為全反式異構體［2］。

蝦青素具有獨特的著色功能，進入動物體內后可以不經修飾或生化轉化而直接貯存、沉積在組織中［3］。蝦青素在保護細胞膜磷酸酯和其他脂類的超氧化方面表現突出。蝦青素在淬滅活性氧的活性及清除自由基方面能力比β-胡蘿卜素高10倍以上，比VE強百倍以上。同時，蝦青素具有抑制脂質過氧化作用，具有顯著降低脂質過氧化物累積的作用［4］。蝦青素還具有一定的抗癌特性。Tanaka等［5］在用硝基喹啉-1-氧化物誘發大鼠口腔癌的類似試驗中，觀察到蝦青素能顯著降低口腔腫瘤的發生率。這些決定了蝦青素的應用價值及商業價值。

雙水相萃取技術是一種操作簡單、易于放大的分離方法，自20世紀60年代提出以來受到廣泛關注。該技術的原理是生物物質在雙水相體系中的選擇性分配。當生物物質進入雙水相體系后，在上相和下相間進行選擇性分配，表現出一定的分配系數。不同的物質在特定的體系中有著不同的分配系數［6］。近30年來，雙水相萃取已涉及酶、核酸、 生長激素、病毒、色素、生物堿等有效成分的分離及提純。但是有關該技術應用于蝦青素的提取和分離尚鮮見相關研究報道。

目前，已有的萃取體系有高聚物-高聚物-去離子水、高聚物-鹽-去離子水、離子液體-鹽-去離子水、小分子有機溶劑-鹽-去離子水等?？紤]到蝦青素易溶于有機溶劑不溶于水的性質，筆者選擇小分子有機溶劑-鹽-水體系，采用乙醇-硫酸銨雙水相體系對蝦青素進行分離研究，旨在為蝦青素雙水相制備的可行性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 ???原材料。冷凍南美白對蝦，購于河北省秦皇島市海港區市場。

1.1.2 ???主要儀器。721型可見光分光光度計，上海舜宇恒平科技有限公司；Sigma 3-30k實驗室高速冷凍離心機，塞維斯科技（北京）有限公司；FA2104N型精密分析電子天平，上海菁海儀器有限公司；FM100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-8型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；H185OR型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；D2F-6050AB型電熱真空干燥箱，天津工興實驗室儀器有限公司；LC-20A型島津高效液相色譜儀，Shimadzu島津公司。

1.1.3 ???主要試劑。蝦青素標準品（S13036-250 mg >98.0%），上海源葉生物科技有限公司；硅膠板（規格50 mm×100 mm；厚度0.20～0.25 mm），青島海洋化工有限公司；甲醇（色譜純）、四氫呋喃（色譜純），天津康科德科技有限公司；無水乙醇（AR）、硫酸銨（AR），天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ???蝦殼中蝦青素的提取。將新鮮的蝦殼用5%稀鹽酸浸沒，攪拌，靜置1 h，至不再有氣泡產生，然后用清水洗至中性，60 ℃下烘干，-10 ℃冰箱保存備用。

為檢測提取時間對蝦青素提取效果的影響，取干燥的蝦殼，粉碎，設置料液比為1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20，在室溫下，用乙醇分別浸提蝦殼，檢測提取1、2、3、4、5、9 h，用每組提取液在476 nm處的吸光度來判斷提取液中蝦青素的含量。每組設置3個平行。

為檢測提取次數對蝦青素提取的影響，分別檢測了料液比分別為1 ∶5、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20，在分別提取1、2、3次（每次提取3 h）時，蝦青素提取液在476 nm的吸光度，并計算蝦青素的提取量。每組3個平行。

樣品液中蝦青素含量的計算根據Beer-Lamben定律［7］，計算公式：

m= A×V×106 A1%1 cm×100

式中，m為類胡蘿卜素含量，μg；

A為溶液吸光度；

V為溶液體積，mL。

其中，吸光系數A1%1 cm為在1 cm光程長的比色杯中1 g/L濃度溶質的理論吸收值。蝦青素標準樣品在乙醇中的吸光系數為2 365 L/（g·cm）。

1.2.2 ???乙醇-硫酸銨雙水相體系的配制。配制質量體積分數分別為10%、20%、30%（w/v）的硫酸銨溶液，取2.0 mL無水乙醇溶液，分別與不同體積的硫酸銨溶液混合，在25 ℃下靜置30 min，觀察并記錄成相情況。

1.2.3 ???乙醇-硫酸銨雙水相溶液萃取蝦殼中的蝦青素。利用“ 1.2.1 ”中的制備方法提取蝦殼中蝦青素，并適當濃縮。然后向一定體積的蝦青素乙醇提取液中（A476 nm=1.694，7.163 μg/mL）加入一定體積的20%、30%的（NH4）2SO4溶液，配制成雙水相，檢測雙水相上相中蝦青素在476 nm處的吸光度。

1.2.4 ???蝦青素的薄層色譜測定。50 mm×100 mm的硅膠板，展開劑為25%丙酮和75%正己烷，完成薄層分離后測Rf值。

1.2.5 ???蝦青素的高效液相色譜檢測。色譜柱為C18：250.0 mm×4.6 mm，采用甲醇（B）和四氫呋喃（A）梯度洗脫的方式（表1），流速0.8 mL/min，檢測波長476 nm，進樣量10 μL，柱溫20 ℃。

2 結果與分析

2.1 乙醇浸提時間對蝦青素提取的影響

在室溫下，通過對4組料液比進行蝦殼中蝦青素提取的研究發現（圖1），4組在提取3 h之前，隨著提取時間的延長，提取液中蝦青素均逐漸增大；提取時間在3 h左右，蝦青素在溶液中濃度達到較高值；3 h以后，隨著浸提時間的延長，蝦青素的濃度反而變得不穩定，除料液比1 ∶ 8組外，基本未出現持續增加的情況，主要趨勢是在3～5 h蝦青素濃度變化不大，5～9 h，除料液比1 ∶ 8組基本呈現下降趨勢，但下降速度不快。這說明在室溫下，提取蝦青素的過程中，3 h左右易達到溶解平衡，提取時間繼續延長，溶解的蝦青素可能發生分解，反而開始下降。因此，在提取蝦殼中蝦青素時，可以設定提取時間為3 h左右。

2.2 乙醇浸提料液比及提取次數對蝦青素提取的影響

稱取0.5 g蝦皮，選擇料液比1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20進行提取，每次提取3 h。從圖2可以看出，提取1次，所獲得提取液蝦青素的吸光度均在0.3以上，對蝦殼提取第2次時，蝦青素的吸光度明顯降低；1 ∶ 5料液比組第2次提取后，吸光度仍較高，1 ∶ 8和1 ∶ 10組提取液的吸光度基本在0.2左右；1 ∶ 15和1 ∶ 20提取液的吸光度較低；提取第3次，1 ∶ 5組提取液中蝦青素的吸光度仍較高。這說明采用1 ∶ 5料液比提取3次，蝦青素有較多的剩余量。

由表2可知，5個料液比下，以1 ∶ 15料液比組提取蝦青素量最多。因此在提取蝦青素時，采用1 ∶ 15料液比較合適。

2.3 乙醇-硫酸銨雙水相溶液的配制

先用10%、20%、30%（w/v） 的硫酸銨溶液和無水乙醇進行混合試驗，以配制25 ℃乙醇-硫酸銨雙水相體系，試驗結果見表3～5。由表3可知，采用10%硫酸銨溶液進行雙水相配制不易形成雙水相。

由表4可知，采用20%硫酸銨溶液進行雙水相配制，無水乙醇 ∶ 20%硫酸銨（v/v）=1 ∶ 1、1 ∶ 1.25、1 ∶ 1.50，可以形成雙水相，且不會出現硫酸銨沉淀，且上相比下相體積大得多。

由表5可知，采用30%硫酸銨溶液進行雙水相配制，較易形成雙水相，在無水乙醇 ∶ 30%硫酸銨（v/v）=1 ∶ 1.50、1 ∶ 1.75、1 ∶ 2、 1 ∶ 2.25、1 ∶ 2.50可 以形成較清晰的雙水相，且上下相比例逐漸減小。

綜上，選擇表4、5中成相體系進行蝦青素的萃取試驗。

2.4 乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取蝦青素

采用表4、5中的雙水相萃取蝦青素，發現乙醇-硫酸銨雙水相體系可將蝦青素溶液分為3相，蝦青素主要以沉淀的形式集中于中間相，部分蝦青素存在于上相，下相澄清（圖3）。

由表6可知，3個20%硫酸銨與無水乙醇形成的雙水相對蝦青素的沉淀率均較高，最高為乙醇 ∶ 20%硫酸銨（v/v）=2 ∶ 2.50體系，蝦青素沉淀率為89.09%。由表7可知，30%硫酸銨與無水乙醇形成的雙水相對蝦青素的沉淀率相對較低，上相中的殘留率較高。

2.5 雙水相體系制備蝦青素的檢測

采用蝦青素乙醇提取液 ∶ 20%硫酸銨（v/v）=2 ∶ 2.50體系提取液中的蝦青素，并對制備的蝦青素進行高效液相色譜分析和薄層色譜分析。

2.5.1 ???高效液相色譜分析結果。

蝦殼中蝦青素的高效液相色譜圖如圖4所示。其中出峰時間4.5 min處是游離蝦青素，出峰時間14.0～20.0 min處是蝦青素一酯，出峰時間29.5～45.0 min處是蝦青素二酯。由此可知，蝦殼中含有多種蝦青素一酯和多種蝦青素二酯，并且游離蝦青素、蝦青素一酯、蝦青素二酯的含量均很高。

雙水相萃取蝦青素的高效液相色譜圖（圖5）與圖4基本相同，說明該雙水相體系可以將蝦殼中各種類型蝦青素萃取出來，可以起到很好地制備蝦青素的目的。

2.5.2 ???薄層色譜分析結果。

從圖6可以看出，雙水相萃取蝦青素與蝦殼中蝦青素提取液相比，游離蝦青素條帶沒有太大差別。蝦青素一酯和蝦青素二酯在雙水相萃取圖中更加清晰，推測可能是由于雙水相萃取不僅能夠將蝦青素沉淀出來，提高了蝦青素的濃度，同時還去除了一部分雜質，如去除了部分與蝦青素結合的蛋白質，使雙水相制備的蝦青素純度更高，蝦青素一酯和二酯的顯色更加清晰。

3 討論

蝦青素的制備一般采用有機溶劑萃取-旋轉蒸發濃縮［8］、超臨界流體萃?。?］、堿提酸沉法［10］、 水沉法［11］等，這些方法不利于蝦青素的進一步分離，有些需要加熱則不利于蝦青素穩定，有些需要比較昂貴的儀器，有些可能造成環境污染。

一般雙水相主要基于物質在上下兩相中的分配不同，來實現不同物質間的分離。但研究發現，在采用雙水相體系進行物質分離時，可能會出現中間相。向不經預處理的有機酸發酵液中加入可溶性無機鹽或有機鹽和萃取劑進行萃取操作，兩相之間會形成一個富含菌體和蛋白的固相層［12］。修志龍等［13］研究表明，向越桔果實殘渣中加入無機鹽溶液和?親水性低分子有機物，分層后，花青素被萃取到上相，殘渣分?配在下相或兩相之間。Li等［14］研究表明，采用乙醇/Na2CO3雙水相體系從培養的冬蟲夏草中分離冬蟲夏草菌絲體多糖時，99.1%的細胞碎片集中于上下兩相之間。

該研究發現，蝦青素在乙醇/硫酸銨雙水相體系中，可形成固相層集中于兩相之間。通過適當的雙水相體系可以使88.0%以上的蝦青素沉淀下來，同時可以去除一些可以溶于上相和下相中的雜質成分，如一些蛋白質、糖類、其他色素等，在使蝦青素形成沉淀的同時，還能提高蝦青素的品質，而且節省了蝦青素脫溶劑的步驟。該方法不需要大量的酸堿，乙醇和硫酸銨都可以回收使用，所以對環境危害性較小，而且該工藝還比較容易擴大生產。因此，該研究可以成為一種制備蝦青素的新方法。

參考文獻

［1］ ?王業勤，李勤生.天然類胡蘿卜素：研究進展、生產、應用［M］.北京：中國醫藥科技出版社，1997：284-287.

［2］ JOHNSON E A，AN G H. Astaxanthin from microbial sources［J］. Critical reviews in biotechnology，1991，11（4）：297-326.

［3］ MEYERS S P，BLIGH D. Characterization of astaxanthin pigments from heat-processed crawfish waste［J］. Journal of agricultural and food chemistry，1981，29（3）：505-508.

［4］ MIKI W. Biological functions and activities of animal carotenoids［J］. Pure and applied chemistry，1991，63（1）：141-146.

［5］ TANAKA T，MAKITA H，OHNISHI M，et al.Chemoprevention of rat oral carcinogenesis by naturally occurring xanthophylls，astaxanthin and canthaxanthin［J］. Cancer research，1995，55（18）：4059-4064.

［6］ 吳敏.雙水相萃取技術在藥物提取與分離中的應用［J］.中成藥，2006，28（10）：1505-1508.

［7］ CALO P，VELAZQUEZ J B，SIEIRO C，et al. Analysis of astaxanthin and other carotenoids from several Phaffia rhodozyma mutants［J］. Journal of agricultural and food chemistry，1995，43（5）：1396-1399.

［8］ 叢心緣，孫偉紅，張輝珍，等.南極磷蝦中不同形態蝦青素的分離制備、結構鑒定及含量分析［J］.食品與發酵工業，2019，45（2）：174-178.

［9］ 翁婷，金銀哲，陶寧萍，等.南極磷蝦中蝦青素超臨界CO2萃取方法研究［J］.天然產物研究與開發，2013，25（10）：1404-1410.

［10］ ?丁純梅，陶庭先，吳之傳.龍蝦蝦殼的綜合利用（Ⅰ）：蝦殼紅色素的提取及其性質研究［J］.化學世界，1995，36（8）：444-445，434.

［11］ 王建剛，秦寶富，曹斌云，等. 從雨生紅球藻中提取總蝦青素的固相萃取方法：CN201210106234.5［P］.2014-08-06.

［12］ 修志龍，宋志遠，魏博超，等.一種鹽析萃取發酵液中有機酸的方法：CN201010511992.6［P］.2014-11-12.

［13］ 修志龍，張華，許鴿，等.一種新型雙水相萃取越桔中花青素的方法：CN200910011206.3［P］.2009-09-16.

［14］ LI Z G，CHEN A L，LI Z C，et al. A novel and environmentally friendly bioprocess for separation and partial purification of polysaccharides from Cordyceps sinensis mycelia by an aqueous two-phase system［J］. RSC advances，2017，7（60）：37659-37665.