SiRNA誘導ROR2表達下調(diào)抑制軟骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲

黃建軍 石鶯 劉泉 陳忠益 曾國慶 趙柏陽

軟骨肉瘤作為發(fā)病率排名第二的原發(fā)惡性骨腫瘤,對放化療具有很強的抵抗作用,外科手術(shù)治療術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,使得預(yù)后效果較差[1],嚴重危及患者生命。因此,探索并闡明軟骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機制,尋找有效的治療靶點是治療軟骨肉瘤的重要策略。受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2,ROR2)是受體酪氨酸激酶家族(RTKs)成員之一,參與體內(nèi)細胞增殖調(diào)控、凋亡、分化、黏附、遷移等多種重要的細胞生理活動,在動物發(fā)育的形態(tài)發(fā)生及組織分化過程中發(fā)揮重要作用[2]。研究表明,ROR2參與調(diào)節(jié)成骨細胞的存活和分化從而影響骨發(fā)育和重塑[3,4]。正常組織中ROR2的表達水平較低,而在多種腫瘤組織或細胞(如慢性淋巴細胞性白血病、惡性黑色素瘤、頭頸鱗癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌等)中呈高表達,并加速腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等過程[5-8]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)ROR2在骨肉瘤組織及細胞中有較強表達,并可能促進了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性生物學行為[9,10]。但筆者發(fā)現(xiàn)ROR2在軟骨肉瘤中的功能尚不清楚。本實驗擬采用體外培養(yǎng)人軟骨肉瘤SW1353細胞,應(yīng)用小干擾RNA(SiRNA)特異性下調(diào)SW1353細胞中ROR2的表達水平,觀察其對軟骨肉瘤SW1353細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,以期為軟骨肉瘤的臨床治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人軟骨肉瘤細胞系SW1353購于美國ATCC公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司;Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、化學發(fā)光試劑盒、CCK-8試劑盒及RIPA裂解液購于碧云天生物公司;鼠抗人ROR2單克隆抗體購于美國novus公司;Transwell小室購自美國Corning公司。小干擾RNA序列由上海博亞公司合成、純化。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組:人軟骨肉瘤SW1353細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,37℃恒溫培養(yǎng)箱,5%的CO2,相對飽和濕度95%的條件下培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀態(tài),每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)液,待細胞生長至匯合度達85%左右時,以胰酶消化傳代。轉(zhuǎn)染前24 h,胰酶消化處于對數(shù)生長期的細胞并計數(shù),用無抗生素含10%胎牛血清的RPMI1640培基稀釋細胞后傳代于6孔板(1×106個/孔)中,保證細胞貼壁后的密度為60%～70% 時,嚴格按SiRNA轉(zhuǎn)染說明書進行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染。將不做任何處理的人軟骨肉瘤SW1353細胞記為空白對照組、將轉(zhuǎn)染了NC-SiRNA的SW1353細胞作為陰性對照組(記為NC組),將轉(zhuǎn)染了ROR2-SiRNA的SW1353細胞作為實驗組(記為ROR2-SiRNA組)。

1.2.2 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中ROR2 mRNA表達水平:通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞,用Trizol試劑提取3組細胞總RNA,紫外分光光度計檢測總RNA純度和濃度后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。調(diào)整cDNA濃度為50 ng/μl后進行熒光定量PCR擴增,以GAPDH基因為內(nèi)參,用相對定量 2-ΔΔCT計算細胞中ROR2 mRNA相對表達水平。見表1。

表1 引物序列

1.2.3 Western blot檢測各組細胞中ROR2蛋白表達水平:收集轉(zhuǎn)染后48 h的后3組SW1353細胞,胰酶消化細胞,1 500 r/min離心10 min,加入100 μl總蛋白提取液,用移液器充分吹打,直到細胞完全被溶解。超聲3次,3 s/次。4℃下12 000 min,離心10 min,取上清,BCA法(按試劑盒說明書步驟進行)測定總蛋白濃度。將總蛋白混合液:蛋白上樣緩沖液=4∶1,混勻,100℃加熱3 min使蛋白質(zhì)變性。離心取上清液20 μl進行12%濃度的SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入鼠抗人ROR2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜,PBST洗膜3次(5 min/次)后,加入二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h。暗室中加入化學發(fā)光ECL顯影液顯影曝光后,凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照,計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值用以表示ROR2蛋白相對表達水平。

1.2.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖能力:取對數(shù)生長期的各組細胞接種于96孔板中,每組設(shè)6個復(fù)孔(6×103個/孔),應(yīng)用CCK-8法分析各組細胞增殖能力是否存在不同。各組細胞分別在37℃下孵育0、24、48和72 h后加入10 μl的CCK-8溶液(每個時間點均設(shè)置3個平行復(fù)孔),繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h,在酶標儀450 nm處測定各孔細胞的光密度(OD)值。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力:取對數(shù)生長期的各組細胞以5×105個細胞/孔的濃度接種到6孔板中過夜。當細胞達到融合時,用無菌20 μl槍頭尖端垂直于橫線劃痕,PBS洗滌3次后,加入無血清培養(yǎng)基。37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育,于劃痕后0、48 h在同一位置用倒置顯微鏡觀察拍照,Image J軟件測量劃痕面積,計算相對劃痕愈合率。相對劃痕愈合率=實驗組(0 h劃痕面積-48 h劃用痕面積)/對照組(0 h劃痕面積-48 h劃痕面積)。

1.2.6 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力:用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部,4℃風干。將Transwell小室放入24孔細胞板上,取對數(shù)生長期細胞制成1×106個/ml無血清細胞懸液,將200 μl的單細胞懸液加入小室上室中,下室中加入600 μl含胎牛血清的完全培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后,取出小室。用40 g/L多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染色10 min,棉簽小心拭去上室面的細胞,PBS清洗殘留染色液,倒置顯微鏡下每組隨機選取取5個視野拍照并計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 3組SW1353細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達水平比較 ROR2-SiRNA組ROR2 mRNA和蛋白的表達水平明顯低于空白對照組和NC組(P<0.05),而空白對照組和NC組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1,表2。

圖1 3組SW1353細胞中ROR2蛋白表達水平;1 空白對照組;2 NC組;3 ROR2-SiRNA組

表2 3組SW1353細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達水平

2.2 3組SW1353細胞增殖能力比較 相同的作用時間,ROR2-SiRNA組OD值明顯低于空白對照組和NC組(P<0.05),而空白對照組與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組細胞增殖能力比較

2.3 3組SW1353細胞劃遷移、侵襲能力 細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,與NC組相比,ROR2-SiRNA組腫瘤細胞的遷移距離明顯變短,遷移能力明顯受到抑制,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示,與NC組比較,ROR2-SiRNA組的穿膜細胞數(shù)明顯減少,侵襲能力明顯減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、3,表4。

圖2 細胞劃痕實驗檢測2組SW1353細胞的遷移能力(×100)

圖3 Transwell實驗檢測2組SW1353細胞的侵襲能力(HE×100)

表4 2組SW1353細胞的遷移距離及穿膜細胞數(shù)的比較n=9,

3 討論

軟骨肉瘤是一種常見的起源于軟骨組織[11]的惡性骨腫瘤,其發(fā)病率僅次于骨肉瘤,好發(fā)于骨盆、股骨近端和肱骨近端、肋骨外,還可以發(fā)生于椎骨、骶骨、鎖骨、肩胛骨和足骨[12]。大多數(shù)軟骨肉瘤繼發(fā)于良性軟骨瘤,如內(nèi)生軟骨瘤和骨軟骨瘤。作為一種較為罕見且尚未被研究透徹的肉瘤的一種亞型,軟骨肉瘤具有高度異質(zhì)性并且難以治療。因其對放療和化療不敏感,目前手術(shù)切除仍然是軟骨肉瘤惟一有效的治療方法[13]。而術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導致絕大多數(shù)軟骨肉瘤患者預(yù)后不良的主要原因。研究表明,除了染色體異常等因素外,軟骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展還與多種癌基因的異常激活和腫瘤抑制因子的失活有關(guān),但其發(fā)生發(fā)展的分子機制仍尚不清楚[14]。尋找影響軟骨肉瘤細胞惡性生物學行為的致癌基因,并探討調(diào)節(jié)軟骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移的分子機制將有助于開發(fā)新的治療策略。

ROR2作為受體酪氨酸激酶家族(RTKs)成員之一參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ROR2在肺癌、胃癌、鼻咽癌和肝癌中表達下調(diào),而在頭頸鱗癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌和骨肉瘤中表達上調(diào),表明ROR2的表達失衡與多種惡性腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。早期的研究已發(fā)現(xiàn),在胰腺導管腺癌中,ROR2表達上調(diào)與患者預(yù)后不良相關(guān)[15],在乳腺癌中,ROR2蛋白表達增高則促進腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。而在結(jié)直腸癌中,ROR2表達下調(diào)且可促進腫瘤細胞增殖和遷移[17]。以上研究結(jié)果表明,ROR2在不同惡性腫瘤中的發(fā)揮不同的功能。

ROR2在軟骨肉瘤中的確切功能尚不清楚。為探討ROR2在軟骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究使用軟骨肉瘤細胞系進行ROR2體外作用的研究。本實驗將ROR2-SiRNA及NC-SiRNA分別轉(zhuǎn)染入人軟骨肉瘤SW1353 細胞后,qRT-PCR和Western blot檢測各組細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達變化,用以檢驗轉(zhuǎn)染效果。實驗結(jié)果顯示與空白對照組和NC組比較,ROR2-SiRNA組細胞中ROR2 mRNA和蛋白的表達水平均明顯降低,提示小干擾RNA成功轉(zhuǎn)染入人軟骨肉瘤SW1353 細胞且顯著抑制軟骨肉瘤細胞中ROR2的表達。CCK-8法檢測結(jié)果顯示與空白對照組和NC組比較,ROR2-SiRNA組中軟骨肉瘤細胞增殖受到明顯抑制,這一結(jié)果證實ROR2具有促進軟骨肉瘤細胞的增殖的作用。劃痕實驗及Transwell實驗結(jié)果顯示,與NC組比較,在抑制軟骨肉瘤細胞中ROR2的表達后,ROR2-SiRNA組中軟骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力明顯降低,表明抑制ROR2的表達能夠有效阻遏軟骨肉瘤細胞的遷移遷移和侵襲。

通過本研究的一系列實驗結(jié)果證實,靶向沉默ROR2的表達可以有效抑制軟骨肉瘤細胞的惡性生物學行為,提示ROR2在軟骨肉瘤中發(fā)揮促癌作用。

綜上所述,ROR2在軟骨肉瘤細胞中表達上調(diào),靶向沉默ROR2表達可有效抑制軟骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究探索了軟骨肉瘤的發(fā)病機制并為后續(xù)軟骨肉瘤的治療提供了理論基礎(chǔ)。