circAMOTL1靶向調控miR-379-5p對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響

周毛仔 陳怡 周進軍

宮頸癌是常見的婦科惡性癌癥,其全球范圍死亡率和發病率在所有女性癌癥位居第四,對女性健康造成嚴重的威脅,宮頸癌早期發現常用外科手術切除,治療效果明顯,但是70%宮頸癌患者發現時已經處于晚期,一些情況下還伴有轉移、侵襲等出現[1,2]。近年來,靶向治療是當前宮頸癌研究和治療的熱點。環狀RNA(circRNA)是非編碼RNA分子的一員,具有穩定的環狀閉合結構,circRNA被發現具有致癌性和抑制性,對多種人類疾病和癌癥至關重要[3,4]。最近的研究發現,circAMOTL1在宮頸癌組織和細胞表達上調,敲低circAMOTL1能抑制宮頸癌細胞的增殖和轉移,并誘導細胞的凋亡,通過調控miR-526b/SIK2軸促進宮頸癌惡性發展[5]。circRNA與下游miRNA能相互作用參與腫瘤細胞的發生和發展,miR-379-5p多種癌癥中表達下調(如肝癌、非小細胞肺癌等),過表達miR-379-5p能抑制癌細胞的增殖和促進細胞凋亡[6,7]。關于circAMOTL1和miR-379-5p二者間的研究尚不明確,通過在線數據庫預測顯示circAMOTL1和miR-379-5p存在互補的核苷酸序列,本研究以宮頸癌細胞Caski為研究對象,觀察circAMOTL1靶向miR-379-5p的表達對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 從本院收集30例宮頸癌患者組織和癌旁組織,經過專家對其病理確認為宮頸癌組織和癌旁組織,將組織放在液氮罐內冷凍保存。所有患者在進行手術前未進行任何化療或放療,且患者均簽署了患者知情同意書。該研究已經獲得了本院倫理委員會同意。

1.2 細胞與主要試劑 正常宮頸上皮細胞End1/E6E7、宮頸癌細胞SiHa、Caski、HeLa、C33a購自上海細胞庫;胎牛血清、DMEM培養基購自美國Hyclone公司;si-NC、si-circAMOTL1、pcDNA、pcDNA-circAMOTL1、anti-miR-NC、anti-miR-379-5p、引物由上海吉瑪設計合成;LipofectamineTM2000試劑盒購自上海加科生物科技有限公司;TRIzol試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司;MTT試劑盒購自碧云天生物;周期試劑盒、凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物;CyclinD1抗體、Ki67抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體、標記的二抗購自北京奧維亞生物技術有限公司;熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.3 細胞培養與轉染 取正常宮頸上皮細胞End1/E6E7、宮頸癌細胞SiHa、Caski、HeLa、C33a于37℃、5% CO2培養內進行培養,細胞須含有10%胎牛血清的DMEM培養基。細胞生長融合至85%時,加入胰蛋白酶進行消化傳代培養細胞。取對數期Caski細胞以每孔內接種2×105個,并接種至6孔板中,按照脂質體法將si-NC、si-circAMOTL1、pcDNA、pcDNA-circAMOTL1轉染至細胞內,記為si-NC組、si-circAMOTL1組、pcDNA組、pcDNA-circAMOTL1組;將si-circAMOTL1和anti-miR-NC、si-circAMOTL1和anti-miR-379-5p共轉染至細胞內,記為si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組。

1.4 qRT-PCR檢測circAMOTL1和miR-379-5p的表達量 取癌旁組織、宮頸癌組織、正常宮頸上皮細胞End1/E6E7、宮頸癌細胞(SiHa、Caski、HeLa、C33a)、以及各組Caski細胞,加入TRIzol試劑用于提取總RNA,對RNA進行定量和評估。然后配置逆轉錄反應體系,取3 μg的總RNA將其逆轉錄為cDNA,根據熒光定量試劑盒說明書步驟配置反應體系,在PCR儀器進行PCR反應。以GAPDH和U6作為內參,采用2-ΔΔCt法計算circAMOTL1和miR-379-5p的表達量。circAMOTL Forward:5’-GATGGTCAAGCCCTACCCTG-3’,Reverse:5’-CCCTGATGCTACTGGTTGCC-3’;miR-379-5p Forward:5’-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3’,Reverse:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.5 MTT檢測細胞增殖 取si-NC組、si-circAMOTL1組、si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組的Caski細胞,并接種至96孔板中,每孔接種2 000個,放置培養箱內培養48 h、72 h,在每孔內加入20 μl的MTT試劑,繼續培養4 h吸去培養液,加入150 μl二甲基亞砜試劑。用酶標儀于490 nm處檢測每孔內吸光度值。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡 取對數期si-NC組、si-circAMOTL1組、si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組的Caski細胞,培養48 h后吸取10 ml上清液至EP管內,加入胰蛋白酶進行消化,沖洗2遍,加入預冷75%乙醇試劑進行重懸,4℃固定24 h,按照周期試劑盒說明書,加入RNA酶孵育20 min,然后加入PI試劑,避光反應30 min,置于流式細胞儀檢測細胞周期變化。加入胰酶消化后,按照凋亡試劑盒說明,將100 μl的Binding Buffer與Annexin V-FITC和PI試劑混勻,避光反應15 min,置于流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。

1.7 Western blot檢測CyclinD1、Ki67、Bax、Bcl-2蛋白表達 取對數期si-NC組、si-circAMOTL1組、si-circAMOTL1+anti-miR-NC組、si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組的Caski細胞,加入蛋白裂解液,冰上反應30 min提取各組細胞內總蛋白,按照BCA法定量評估蛋白。每孔上樣量為30 μg與上樣緩沖液反應3 min,行SDS-PAGE處理,將處理的蛋白轉移PVDF膜上,然后用脫脂奶粉封閉培養1 h,洗膜3次,加入CyclinD1、Ki67、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體,4℃孵育過夜,室溫下加入帶有標記的二抗,孵育1 h,在PVDF膜滴加ECL顯色液,顯色、曝光。應用Image分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內參。

1.8 雙熒光素酶報告實驗檢測circAMOTL1和miR-379-5p的靶向關系 通過在線數據庫預測circAMOTL1 3’UTR與miR-379-5p結合位點,為了驗證miR-379-5p是否是circAMOTL1的靶標。將構建circAMOTL1野生型(circAMOTL1 WT)和突變型(circAMOTL1 MUT)熒光序列載體與miR-NC或miR-379-5p共轉染至Caski細胞內,培養48 h后,根據熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測細胞內熒光素酶活性。

2 結果

2.1 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌組織中的表達 與癌旁組相比,宮頸癌組織內circAMOTL1表達量顯著增加(P<0.05),miR-379-5p表達量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌組織中的表達

2.2 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌細胞中的表達 與正常宮頸上皮細胞End1/E6E7相比,宮頸癌細胞SiHa、Caski、HeLa和C33a內circAMOTL1表達量顯著增加(P<0.05),miR-379-5p表達量顯著降低(P<0.05)。因此選擇表達量差異相對較大Caski細胞進行后續實驗。見表2。

表2 circAMOTL1和miR-379-5p在宮頸癌細胞中的表達

2.3 敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞增殖的影響 與si-NC組相比,si-circAMOTL1組內circAMOTL1表達量顯著降低(P<0.05),48h、72h內OD值顯著降低(P<0.05),G0/G1期細胞比例顯著上升(P<0.05),S期細胞比例顯著降低(P<0.05),CyclinD1、Ki67蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1,表3。

表3 敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞增殖和周期的影響

2.4 敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞凋亡的影響 與si-NC組相比,si-circAMOTL1組內細胞凋亡率顯著上升(P<0.05),Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達顯著上升(P<0.05)。見圖2,表4。

圖2 敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞凋亡的影響;A 凋亡圖;B 蛋白圖

2.5 circAMOTL1靶向調控miR-379-5p的表達 通過在線數據庫預測顯示,circAMOTL1和miR-379-5p互補核苷酸序列。為了進一步驗證二者間的關系,雙熒光素酶報告實驗結果顯示,與miR-NC組相比,miR-379-5p組內circAMOTL1 WT熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),circAMOTL1 MUT熒光素酶活性沒有顯著變化。與pcDNA組相比,pcDNA-circAMOTL1組內circAMOTL1表達量顯著上升(P<0.05),miR-379-5p表達量顯著降低(P<0.05)。見圖3,表5、6。

表4 敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞凋亡的影響

圖3 circAMOTL1和miR-379-5p互補核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 circAMOTL1調控miR-379-5p的表達

2.6 抑制miR-379-5p部分回復敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響 與si-circAMOTL1+anti-miR-NC組相比,si-circAMOTL1+anti-miR-379-5p組內miR-379-5p表達量顯著降低(P<0.05),48 h、72 h內OD值顯著上升(P<0.05),G0/G1期細胞比例顯著降低(P<0.05),S期細胞比例顯著上升(P<0.05),細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),CyclinD1、Ki67、Bcl-2蛋白表達顯著上升(P<0.05),Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表7、8,圖4。

表7 抑制miR-379-5p部分回復敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞凋亡的影響

表8 抑制miR-379-5p部分回復敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞增殖和周期的影響

圖4 抑制miR-379-5p部分回復敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響;A 蛋白圖;B 凋亡圖

3 討論

宮頸癌作為常見的惡性腫瘤,雖然宮頸癌的診斷和治療方法已經取得了進步,但是患者的不良預后、復發是當前治療的難題[8]。circRNA是新發現的內源RNA,在多種癌癥內異常表達,可以作為癌癥的潛在生物標記物[9,10]。circAMOTL1位于人染色體11上,在癌癥內表達上調,如circAMOTL1在乳腺癌組織內表達上調,通過參與乳腺癌細胞的增殖、凋亡等促進乳腺癌的發展[11]。Liu等[12]研究結果發現,circAMOTL1在口腔鱗狀細胞癌內表達上調,circAMOTL1通過調控miR-22-3p/miR-1294促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖。Ou等[13]研究結果發現,circAMOTL1宮頸組織內表達上調,與不良預后有關,抑制circAMOTL1能抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移,并誘導細胞的凋亡,通過調控miR-485-5p/AMOTL1軸發揮在宮頸癌內的作用。以上均說明circAMOTL1在癌癥內起到促癌的作用,可以作為宮頸癌的潛在標記物,本研究結果顯示,通過qRT-PCR檢測宮頸癌組織和細胞內circAMOTL1的表達量,發現circAMOTL1在宮頸癌組織和細胞內表達上調,通過體功能實驗觀察敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的作用。結果顯示抑制circAMOTL1能降低宮頸癌細胞內OD值,增加G0/G1期細胞比例、細胞凋亡率,減少S期細胞比例,下調CyclinD1、Ki67、Bcl-2蛋白表達,上調Bax蛋白表達,說明circAMOTL1在宮頸癌起著促癌的作用,這與上述結果相似。

miR-379-5p屬于miR-379家族,在人類癌癥中表達異常失調,能參與多種癌癥的發生和發展[14,15]。Jiang等[16]研究結果顯示,在非小細胞肺癌組織和細胞中miR-379-5p表達下調,miR-379-5p通過靶向β-arrestin-1的表達抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和促進細胞的凋亡。在乳腺癌的研究中發現,miR-379-5p在乳腺癌組織內表達下調,LINC00665負調控miR-379-5p的表達抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移[17]。陳昆等[18]研究結果顯示,miR-379-5p在膀胱癌組織和細胞內表達下調,上調miR-379-5p能抑制膀胱癌細胞的增殖和轉移。有研究結果顯示miR-379在宮頸癌組織和細胞中表達下調,與癌癥分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關[19],過表達miR-379能抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲。以上均說明miR-379-5p在癌癥中表達失常,可以作為多種癌癥的標記物,本研究結果發現,miR-379-5p在宮頸癌組織和細胞內表達下調,說明miR-379-5p在宮頸癌中起著抑癌的作用,這與上述結果一致。通過在線數據庫預測顯示miR-379-5p是circAMOTL1靶基因,qRT-PCR結果顯示,過表達circAMOTL1能降低miR-379-5p的表達水平,說明circAMOTL1靶向負調控miR-379-5p。進一步實驗結果顯示,抑制miR-379-5p可以逆轉敲低circAMOTL1對宮頸癌細胞增殖、周期和凋亡的作用,說明circAMOTL1靶向負調控miR-379-5p促進宮頸癌惡性發展。

綜上所述,circAMOTL1在宮頸癌組織和細胞內高表達,敲低circAMOTL1能抑制宮頸癌細胞的增殖和促進細胞的凋亡,并阻滯細胞周期,其作用機制可能與miR-379-5p有關,為宮頸癌的治療和診斷提供新的靶標。