天麻素經IRE1α/TRAF2/NF-κB通路調控大鼠急性心肌梗死誘導的炎性反應及機制研究

李小玲 鐘小蘭 方志敏 劉順民 劉兆平

急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)是臨床常見的心血管疾病危重癥之一,具有發病突然、病死率高的特點,當前經皮冠狀動脈形成術及血管緊張素轉換酶抑制劑等藥物的應用有效降低了AMI患者病死率[1]。但心肌細胞是一種終末分化細胞,死亡后不可再生,而AMI后心肌組織釋放多種自身抗原,導致機體自身免疫反應,誘發一系列炎性反應,對心肌細胞產生負性作用,引起心功能進行性障礙,最終影響患者預后并增加患者猝死風險。因此,尋找緩解AMI所致炎性反應的有效藥物或靶點是醫藥研究工作者的重要課題[2-4]。天麻素(gastrodin)是提取自中藥蘭科天麻屬植物天麻塊莖的主要有效成分,具有抗菌、抗炎、抗氧化等廣泛的藥理作用[5]。Liu等[6]研究顯示,天麻素可抑制動脈粥樣硬化小鼠早期炎性反應。楊偉等[7]研究報道,天麻素可通過抑制炎性反應和氧化應激減輕心臟缺血再灌注損傷,但天麻素作用于AMI的效果及作用機制尚不清楚。因此,本研究制備AMI大鼠模型,探究天麻素對AMI誘導的炎性反應的影響并探討其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級雄性SD大鼠,6～8周齡,體重180～200 g[新疆醫科大學實驗動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(新)2018-0002]。置于恒溫25℃動物房分籠飼養,12 h明暗交替,自由進食、飲水。天麻素(純度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);戊巴比妥鈉(上海思域化工科技有限公司);腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenytetrazolium chloride,TTC)染色試劑盒、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司);RIPA裂解液、BCA試劑盒(上海碧云天生物技術研究所);兔抗肌醇依賴性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α),磷酸化IRE1α(p-IRE1α)、腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2,TRAF2)、p65、磷酸化p65(p-p65)抗體、鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及AMI模型制備:50只SD大鼠適應性喂養1周后,隨機分為假手術(Sham)組、模型(AMI)組、天麻素低劑量(L-GAD)組、天麻素高劑量(H-GAD)組、卡托普利(CAP)組,每組10只。除Sham組外,其他4組大鼠參照文獻[8]建立AMI大鼠模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定于手術臺上,氣管插管連接呼吸機后行開胸術,采用6-0無菌絲線在左心耳下1～1.5 mm處結扎冠狀動脈左前降支,左室前壁心肌顏色由鮮紅色變為蒼白色即為結扎成功,清理胸腔后關閉胸腔,逐層縫合。術后24 h大鼠心電圖可見ST段呈弓形向上型抬高,表示造模成功。Sham組大鼠同上述操作,僅穿線不結扎冠狀動脈。術后5組大鼠均使用10萬U青霉素抗感染,連續3 d。

1.2.2 藥物處理:術后24 h 造模成功后,L-GAD、H-GAD組大鼠分別按照50 mg/kg、100 mg/kg劑量尾靜脈注射給藥,CAP組大鼠尾靜脈注射6.25 mg/kg卡托普利,AMI組和Sham組大鼠尾靜脈注射相同劑量0.9%氯化鈉溶液,1次/d,連續給藥4周后取大鼠組織標本進行檢測。

1.2.3 超聲心動圖檢測大鼠心功能變化情況:術后4周末,麻醉大鼠,進行心臟超聲檢測,記錄左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)、收縮末期左心室內徑(left ventricular end-systolic diameter,LVDs)、舒張末期左心室內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVDd)。

1.2.4 組織標本收集:術后4周末,5組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,采用腹主動脈采血法處死大鼠,抽取的血液置于冰盒30 min后,在4℃條件下,3 500 r/min離心10 min,取上清液,分裝至1.5 ml的EP管,-80℃保存備用。摘取大鼠心臟,置于4℃ 0.9%氯化鈉溶液浸泡,用無菌醫用紗布吸去多余水分,在心臟最大橫頸部位小心切開心臟,部分心肌組織置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h,隨后進行組織脫水、透明、石蠟包埋等操作,制備石蠟切片,另一部分心肌組織裝入凍存管,置于液氮保存備用。

1.2.5 TTC染色評估大鼠心肌梗死面積比:取凍存的大鼠心肌組織,用磷酸緩沖鹽(PBS)溶液清洗后,將心肌組織切成5片冠狀切片,將切片置于1%的TTC染液中,37℃避光孵育20 min,隨后在4%多聚甲醛中固定24 h,拍照觀察,正常心肌區域呈現紅色,梗死區域呈現白色,計算心肌梗死面積比,梗死面積比=梗死區域面積/切面總面積×100%。

1.2.6 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態學變化情況:取5組石蠟切片,脫蠟后用蘇木精染色10 min,自來水沖洗后,用1%的鹽酸乙醇溶液分化1 min,自來水洗滌后,再用伊紅染色3 min,沖洗后,將組織切片用不同濃度的乙醇逐級脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理形態學變化。

1.2.7 ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1含量:取5組保存備用的大鼠血清,按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1對應的吸光度(OD)值,在提前繪制的標準曲線上根據樣本OD值查出相應濃度,計算TNF-α、IL-6、MCP-1含量。

1.2.8 qRT-PCR檢測大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達水平:取5組大鼠心肌組織,加入Trizol試劑提取組織總RNA,紫外分光光度法測定總RNA得純度和濃度,將RNA反轉錄合成cDNA,根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書配置qRT-PCR實驗反應體系,進行PCR擴增。反應條件:95℃ 15 min,95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共進行40個循環,以GAPDH為內參基因,采用2-ΔΔCt定量方法計算目的基因相對表達量。見表1。

表1 引物序列

1.2.9 Western blot法檢測大鼠心肌組織中IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達情況:取凍存的心肌組織,加入RIPA裂解液提取組織總蛋白,按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度,經SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移至PVDF膜上,5 %脫脂牛奶中室溫封閉1 h,加入IRE1α(1∶1 000)、p-IRE1α(1∶1 000)、TRAF2(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,洗滌后加入HRP標記的二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,經化學發光法顯影后,以β-actin作為內參蛋白,使用凝膠成像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 天麻素對大鼠心功能及心肌梗死面積比的影響 Sham組大鼠心功能參數正常,未見心肌梗死;與Sham組比較,AMI組大鼠心功能參數LVEF顯著降低,LVDs和LVDd顯著升高,且存在明顯的心肌梗死,差異均有統計學意義(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠心功能參數LVEF均顯著升高,LVDs和LVDd均顯著降低,且心肌梗死面積比均顯著減小,差異均有統計學意義(P<0.05);H-GAD組和CAP組大鼠心功能參數LVEF、LVDs、LVDd及心肌梗死面積比變化程度與L-GAD組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖1。

表2 天麻素對大鼠心功能及心肌梗死面積比的影響 n=10,

圖1 天麻素對大鼠心肌梗死面積比的影響(TTC染色檢測大鼠心肌梗死面積比)

2.2 天麻素對大鼠心肌組織病理形態學變化的影響 Sham組心肌細胞排列整齊、核結構正常,細胞形態未見明顯異常;AMI組大鼠心肌細胞排列紊亂,細胞著色不均,發生大量變性、壞死,心肌纖維腫脹、斷裂,可見大量炎性細胞浸潤;與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織損傷明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯減少,且H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織損傷改善較L-GAD組更為顯著。見圖2。

2.3 天麻素對大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量的影響 與Sham組比較,AMI組大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平顯著升高(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平顯著降低(P<0.05),且H-GAD組和CAP組大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1水平較L-GAD組降低更為明顯(P<0.05)。見表3。

圖2 天麻素對大鼠心肌組織病理形態學變化的影響(HE×400)

表3 天麻素對大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量的影響 n=10,pg/ml,

2.4 天麻素對大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達的影響 與Sham組比較,AMI組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達量顯著升高(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD、H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達量顯著降低(P<0.05),且H-GAD組和CAP組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達量較L-GAD組降低更為明顯(P<0.05)。見表4。

表4 天麻素對大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達的影響 n=10,pg/ml,

2.5 天麻素對大鼠心肌組織IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達的影響 與Sham組比較,AMI組大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均顯著升高(P<0.05);與AMI組比較,L-GAD和H-GAD組大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均顯著降低(P<0.05),且H-GAD組大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值較L-GAD組降低更為明顯(P<0.05)。見圖3,表5。

3 討論

現代藥理學研究發現,天麻素具有抗炎、抗氧化、抗血小板、降低血壓和增強免疫功能的作用,對中樞系統、心血管系統和免疫系統等均具有較強的藥理活性[9]。Li等[10]研究表明,天麻素通過激活PI3K-Akt通路中mTOR信號抑制細胞自噬,從而保護新生大鼠心肌細胞免受缺氧/復氧損傷。Fu等[11]報道,天麻素預處理通過促進自噬流量減輕心肌缺血再灌注損傷。Xing等[12]報道,天麻素通過上調 microRNA-21保護大鼠心肌細胞 H9c2免受缺氧損傷。本研究建立AMI大鼠模型,造模后,HE染色法觀察顯示AMI大鼠心肌細胞排列紊亂,發生大量變性、壞死,心肌纖維腫脹、斷裂,存在大量炎性細胞浸潤;TTC法檢測顯示AMI大鼠存在明顯的心肌梗死;同時,大鼠心功能參數發生異常。經過天麻素干預后,大鼠心肌組織病理損傷減輕,心肌梗死面積減小,心功能參數顯著改善,提示天麻素能夠減輕AMI引起的心肌損傷。

圖3 天麻素對大鼠心肌組織IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達的影響

表5 天麻素對大鼠心肌組織IRE1α/TRAF2/NF-κB通路蛋白表達的影響 n=10,pg/ml,

炎性反應是機體常見的病理過程,可發生于機體各組織和器官,AMI后,梗死區缺血缺氧,心肌能力供給不足,心肌細胞代謝、氧化應激及鈣離子通道等多方面改變使得細胞發生壞死與凋亡,進一步引起強烈的炎性反應,加重心肌損傷。抑制AMI后過度炎性反應可能對心功能改善起積極的影響[13]。TNF-α和IL-6作為炎癥及調節機體免疫的重要細胞因子,臨床檢查顯示TNF-α和IL-6在心血管疾病患者的心肌組織中高表達,且表達水平與疾病的嚴重程度密切相關[14]。MCP-1在心肌缺血中屬于較為活躍的趨化因子,可誘導單核細胞向內皮細胞趨化并黏附,參與心肌缺血誘導的炎性反應,促進單核細胞轉化為巨噬細胞[15]。TNF-α、IL-6、MCP-1共同參與梗死心肌炎性反應的全過程,調節TNF-α、IL-6、MCP-1的釋放對減輕心肌缺血性損傷至關重要。Han等[16]報道,天麻素通過調節凋亡相關信號蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和炎性細胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的表達,對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用。本研究中,AMI大鼠血清及心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1炎性因子表達均升高。天麻素干預后,AMI大鼠血清及心肌組織中TNF-α、IL-6、MCP-1炎性因子水平均顯著降低,提示天麻素對AMI誘導的炎性反應有一定抑制作用。

TRAF2是腫瘤壞死因子受體相關因子家族中的一員,可與腫瘤壞死因子受體家族的多個受體結合,介導相關因子的生理活化,被認為是調節NF-κB表達的關鍵上游因子。IRE1α則是內質網應激過程中參與未折疊蛋白激活的保守信號通路的重要組成部分。IRE1α通過與TRAF2結合被磷酸化激活,導致NF-κB通路的激活,而NF-κB的激活是抗原呈遞細胞產生炎性因子的重要步驟,NF-κB包含p65、p50等多個亞單位,在正常生理狀態下,以無活性的同源二聚體形式存在,當多種病理因素刺激時,NF-κB被磷酸化被激活,轉移至細胞核內與特定靶基因結合發揮調控基因轉錄作用,釋放炎性因子等,導致組織過度炎性反應及損傷。多項研究報道,IRE1α/TRAF2/NF-κB通路通過調節炎性反應參與多種疾病的發生發展[17]。Yuan等[18]研究發現,天麻素可通過介導IRE1α/TRAF2/NF-κB通路抑制大鼠肝移植急性排斥反應。

本研究結果顯示,AMI大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均明顯升高,而經過天麻素干預后,AMI大鼠心肌組織中TRAF2蛋白表達量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值均明顯降低。該結果提示天麻素可能通過調控IRE1α/TRAF2/NF-κB通路抑制AMI誘導的炎性反應,減輕AMI大鼠心肌損傷和心肌梗死面積。