隔三七餅灸調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路對創傷性骨關節炎大鼠軟骨損傷的影響

燕煉鋼 周婷 賈澤坤 李靜 王儲蓄

創傷性骨關節炎(traumatic osteoarthritis,TOA)是骨關節炎(osteoarthritis,OA)的一種亞型,發生于關節損傷后,關節軟骨磨損、退化變性為TOA的主要病理改變,造成患者膝關節疼痛、活動障礙[1]。諸多證據表明,炎性反應是介導TOA病理過程重要且不可避免的促成因素,其中核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是介導炎性反應的關鍵因子,其通過核易位而活化,調控促炎因子表達,誘導炎性發生[2]。蛋白翻譯后修飾在NF-κB核易位過程中扮演著重要角色,如經乙酰化、甲基化、磷酸化等,沉默交配型信息調節因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)是一種常見的去乙酰化酶,其可誘導NF-κB去乙酰化,從而抑制其核易位,減輕炎性反應[3,4]。而SIRT1在一定程度上受5’磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的調控[5]。故而AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路被認為是抑制炎性反應的重要靶向信號通路。中醫將TOA歸屬于“骨痹”“痹癥”范疇[6]。隔藥灸為艾灸的形式之一,其較直接灸火力溫和,且可實現艾灸和藥物雙重作用,適用于諸多慢性疾病的治療[7,8]。三七又名人參三七,有散瘀活血、消腫止痛的功效,且現代藥理學研究顯示,三七亦具有顯著的抗炎療效[9]。目前已有研究報道隔三七餅灸對OA取得了較好的療效[10],但其作用機制仍不清楚。基于上述內容,本研究采用經典Hulth方法復制TOA大鼠模型,觀察隔三七餅灸對TOA大鼠軟骨損傷的影響,并探究調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路作為其藥理機制的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級SD大鼠,雄性,體重280～300 g,購自北京華阜康生物公司[許可證號:SYXK(京)2019-0022]。喂養環境:12 h光/12 h暗交替模式,溫度22～26℃,濕度40%～55%,自由攝食、進水。

1.2 主要試劑 三七粉、艾絨由本院中藥房提供;AMPK抑制劑Compound C(MedCheExpress公司);HE染色、番紅-固綠染色試劑盒(上海源葉生物公司);一氧化氮(NO)檢測試劑盒、RIPA裂解液、核蛋白抽提試劑盒、BCA試劑盒(均碧云天生物公司);白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)Elisa檢測試劑盒(均上海酶研生物公司);基質金屬蛋白酶(MMP)-1,3 Elisa檢測試劑盒(均武漢華美生物工程有限公司);兔源一抗Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ)、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、SIRT1、乙酰化NF-κB(ac-NF-κB)、anti-Histone H3、anti-GAPDH(均Abcam公司);兔源一抗NF-κB(北京百奧萊博科技公司);山羊抗兔二抗(Absin公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗藥物制作:①三七餅制作法:取三七粉10 g,加入5 ml 60%酒精調制為濃稠糊狀,隨后做成直徑約3 cm、厚約0.8 cm的餅狀,用針在餅中間刺10個小孔,利于艾灸熱力的傳導。②艾炷制作法:取艾絨2 g,反復揉搓使之緊實,隨后通過邊旋轉、邊捏,使其變成圓錐形(上尖下平)的艾炷。

1.3.2 實驗分組及模型構建:隨機把40只大鼠分為假手術(sham)組、TOA組、隔三七餅灸組、扶他林組、隔三七餅灸+AMPK抑制劑組,每組8只。采用經典Hulth方法復制TOA模型[11],將大鼠麻醉后固定,消毒膝關節后打開關節腔,切斷前后交叉韌帶,移除內側半月板,sham組僅做打開關節腔處理。術后抗炎3 d。術后1周根據分組進行干預。

1.3.3 治療方法:將隔三七餅灸組大鼠麻醉、固定于鼠臺上,參考《小動物針灸法手冊》對其進行穴位定位,取足三里穴、腎俞穴并進行備皮,將三七餅置于穴位上,艾炷置于三七餅上方,隨后開始艾灸,每次每穴灸5個艾炷(藥餅烤干時及時更換),以灸側皮膚紅潤且不起泡為度,隔日1次,10次為1個療程,共治療2個療程(療程間隔5 d);隔三七餅灸+AMPK抑制劑組在隔三七餅灸組處理基礎上腹腔注射AMPK抑制劑,每次10 mg/kg,1次/周,連續給藥3周;對扶他林組大鼠行膝關節周圍備皮,而后均勻涂抹扶他林,2次/d,10次為1個療程,共治療2個療程(療程間隔5 d)。

1.3.4 HE染色和番紅-固綠染色觀察軟骨組織病理改變:于末次給藥后次日,處死大鼠,取出膝關節軟骨組織,將一部分經4%多聚甲醛固定24 h后置于EDTA脫鈣液中脫鈣15 d,隨后進行組織脫水、石蠟包埋、切片(4 μm厚),進行常規HE染色和番紅-固綠染色,于顯微鏡下觀察分析,并進行Mankin’s評分[12],得分越高表示病變越嚴重。剩余軟骨組織保存于-80℃備用。見表1。

1.3.5 免疫組化檢測軟骨組織中Collagen Ⅱ 陽性表達情況:取2.4制作好的切片,常規脫蠟水化處理后進行抗原修復,而后浸于3%H2O2溶液中10 min以滅活過氧化物酶活性,浸于5%山羊血清中封閉非特異性位點,而后孵育兔抗大鼠一抗Collagen Ⅱ(4℃過夜),次日孵育山羊抗兔二抗(37℃ 30 min),DAB顯色液孵育5 min,蘇木精復染2 min,而后脫水、透明、封片,于顯微鏡下觀察,利用Image J軟件進行定量分析。

表1 Mankin’s評分標準

1.3.6 檢測軟骨組織中炎性介質水平:取1.3保存的軟骨組織,勻漿后離心收集上清,采用NO檢測試劑盒,IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-13 Elisa檢測試劑盒測定上清中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-13水平。

1.3.7 Western Blot檢測軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關蛋白表達情況:取1.3.4保存的軟骨組織,利用RIPA裂解液提取總蛋白或利用核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白,BCA法測定濃度,加入2×蛋白上樣緩沖液定量后進行沸水浴變性,而后經凝膠電泳分離蛋白、轉模,5%脫脂奶粉封閉后孵育兔源一抗AMPK、p-AMPK、SIRT1、NF-κB、ac-NF-κB、anti-Histone H3、anti-GAPDH(4℃過夜),次日孵育山羊抗兔二抗(室溫2 h),最后滴加ECL顯色劑、置于凝膠成像系統中拍照,最后借助Image J軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 5組軟骨組織病理改變 Sham組軟骨表面光滑,軟骨細胞豐富、排列整齊;TOA組軟骨層變薄,表面出現裂隙樣破壞,軟骨細胞大量減少、排列紊亂,蛋白多糖明顯丟失,Mankin’s評分增高,經隔三七餅灸或扶他林干預后,軟骨組織病變明顯減輕,Mankin’s評分下降,且隔三七餅灸干預改善更明顯;隔三七餅灸+AMPK抑制劑組較隔三七餅灸組軟骨病變加重,Mankin’s評分增高。見表2,圖1。

表2 5組軟骨組織Mankin’s評分 n=8,分,

2.2 5組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達情況 與Sham組比較,TOA組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達下降(P<0.05);與TOA組比較,隔三七餅灸組、扶他林組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達增高,且隔三七餅灸組增高更明顯(P<0.05);與隔三七餅灸組比較,隔三七餅灸+AMPK抑制劑組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達下降(P<0.05)。見圖2,表3。

圖1 5組軟骨組織病理改變(×200)

圖2 Collagen Ⅱ免疫組化染色(×200)

表3 5組軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達情況 n=8,

2.3 5組軟骨組織中炎性介質水平 與Sham組比較,TOA組軟骨組織中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平增高(P<0.05);與TOA組比較,隔三七餅灸組、扶他林組軟骨組織中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平下降,且隔三七餅灸組下降更明顯(P<0.05);與隔三七餅灸組比較,隔三七餅灸+AMPK抑制劑組軟骨組織中NO、IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-3水平增高(P<0.05)。見表4。

表4 5組軟骨組織中炎性介質水平 n=8,

2.4 4組軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關蛋白表達 與Sham組比較,TOA組軟骨組織中p-AMPK、SIRT1蛋白表達下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達增高(P<0.05)(P<0.05);與TOA組比較,隔三七餅灸組軟骨組織中p-AMPK、SIRT1蛋白表達增高,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達下降,差異均有統計學意義(P<0.05);與隔三七餅灸組比較,隔三七餅灸+AMPK抑制劑組軟骨組織中p-AMPK、SIRT1蛋白表達下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達增高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5,圖3。

表5 4組軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關蛋白表達情況 n=8,

圖3 AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關蛋白Western Blot條帶圖;A Sham組; B TOA組;C 隔三七餅灸組;D 隔三七餅灸+AMPK抑制劑組

3 討論

TOA為OA的一種常見類型,易發生于膝蓋、腳踝、肘關節、腕關節等部位,其發病率越來越高[1]。目前認為,長期的炎性刺激是介導TOA發病的主要病理基礎,NO、IL-1β、TNF-α等為常見的炎性因子,不僅可抑制軟骨細胞的增長,還可誘導MMP-1、MMP-3等蛋白酶的產生,使軟骨中的膠原蛋白及蛋白多糖被分解,進而導致軟骨損傷[13,14]。本研究結果顯示,相比于Sham組,TOA組軟骨組織軟骨層變薄,表面出現裂隙樣破壞,軟骨細胞大量減少,蛋白多糖明顯丟失,Mankin’s評分增高,同時MMP-1、MMP-3水平增高,Collagen Ⅱ陽性表達下降,此外,NO、IL-1β、TNF-α水平增高,表明TOA大鼠軟骨組織存在明顯炎性反應及軟骨損傷。

臨床研究顯示,非甾體抗炎藥如扶他林為臨床治療TOA的常用藥物,可在一定程度上消炎、鎮痛,但效果仍不盡理想[15]。筆者發現近年來,研究者逐漸把目光投向了我國的傳統醫學。TOA屬傳統醫學“骨痹”“痹癥”范疇,主要病機為外傷或勞損致氣血瘀滯,經絡閉阻,不通則通,筋骨失養,久之骨節偏枯,關節失動[16]。艾灸是傳統醫學的特色外治方法之一,主要借助灸火的熱力,通過經絡傳導,以達到散瘀散節、活血行氣的功效[17]。

隔藥灸為艾灸的一種常見形式,可實現艾灸和藥物的雙重作用。已有大量研究報道隔藥灸對OA及類風濕性關節炎具有顯著的療效[7,8]。在本研究中,我們選用三七作為隔藥灸的藥物,其不僅具有化瘀、散血、止痛的功效,亦具有抗炎的功效[9]。足三里穴、腎俞穴為常用的防病強壯穴,其中足三里穴具有扶正祛邪,補氣益中、通經活絡的功效;腎俞穴不僅可溫陽補腎,強化骨骼,且可疏通諸陽經經氣,使經絡通暢,二者綜合使用,可達到相互滋生、兼顧的功效[18,19]。本研究結果表明隔三七餅灸能夠抑制TOA大鼠軟骨組織炎性反應,減輕軟骨損傷,且效果顯著。

SIRT1/NF-κB是介導炎性反應的重要信號通路之一,且該通路已被大量研究證實與OA的發生和進展密切相關,其作用機制為SIRT1是一種去乙酰化酶,通過誘導NF-κB去乙酰化而抑制其核易位,進而抑制炎性因子的釋放[3,4]。此外,諸多研究表明AMPK磷酸化活化后可調控SIRT1表達,激活SIRT1/NF-κB通路[5]。

為了探究調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路是否為隔三七餅灸的可能藥理機制,我們首先檢測了隔三七餅灸干預后,TOA大鼠軟骨組織中AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路相關蛋白表達的變化,結果發現p-AMPK、SIRT1蛋白表達下降,ac-NF-κB、核NF-κB蛋白表達增高,提示隔三七餅灸能夠調控AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路。然后我們在隔三七餅灸干預的同時給予AMPK抑制劑Compound C干預,結果發現TOA大鼠軟骨組織炎性反應及損傷加重,證實調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路為隔三七餅灸的藥理機制。

綜上所述,隔三七餅灸能夠減輕TOA大鼠軟骨損傷,可能與調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路有關。希望本研究能為隔三七餅灸應用于治療TOA提供參考依據。