基于組織病理學的大鼠腦干原發性功能損傷程度研究#

傅倩穎 石菁菁 王國祥 朱林娜 王訊 楊袖菊 劉盛雄Δ

（1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054；2.重慶大學生物工程學院，重慶 400030）

彌散性軸索損傷（Diffuse axonal injury，DAI）是指頭部遭受鈍性外力作用后引起的以腦白質軸索彌散性損傷為主要特征的一種腦損傷[1]，與創傷性腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）密切相關[2,3]，是導致TBI 患者嚴重神經功能障礙、植物生存和死亡的最重要原因之一[4]。中國TBI 中心統計了2014～2017 年間13627 例顱腦損傷病例[5]，10334 例為輕微至中度TBI 病人，道路交通事故是這些TBI 患者的主要損傷原因（6548 例，占總病例的50%），男性多于女性。據公安部統計[6]，2020 年全國共發生244674 起交通事故，交通事故導致的死亡人數中，1/3～1/2 為創傷性顱腦損傷TBI。美國每年約發生210 萬例TBI，在非占位性TBI 死亡率和致殘率中DAI 占35%[7,8]。DAI多見于道路交通事故、高墜和頭部鈍性打擊等[9]。交通事故導致的傷殘形勢嚴峻，而醫學上使用格拉斯哥昏迷評分法（Glasgow coma scale，GCS）評估病人昏迷程度[10]，或者基于頭部碰撞標準（Head injury criterion，HIC）、累計應變損傷指標（Cumulative strain damage measure，CSDM）等方法以軟組織變形、水腫、出血和骨折等對顱腦進行損傷評判[11,12]，對交通事故所致的傷情調查研究普遍采用簡明損傷評分（Abbreviated injury scale，AIS）等[13]，現有的損傷評級標準缺少神經損傷造成的病理性功能障礙程度的客觀標準。如何更有效地在腦損傷發生早期就對腦損傷程度有一個明確的判斷對后續進行腦部診斷、治療和恢復起著重要作用[14]。為此，我們用蘇木精-伊紅（Hematoxylin eosin staining，HE）染色結合β-淀粉樣前體蛋白（β-Amyloid precursor protein，β-APP）免疫組織化學染色法，對實驗組大鼠腦干進行不同程度的原發性致傷，對腦干損傷程度進行定量分類。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選24 只成年健康SD 雄性大鼠（由遼寧長生生物技術股份有限公司（許可證號NO.SCXK（遼）2020-0001 提供），體質量300～400 g，隨機分為正常對照組、1.25 m 致傷實驗組和2.25 m 致傷實驗組，共3 組，每組8 只。實驗前將大鼠放置在安靜、室溫22～28℃、避強光的環境內適應性飼養。

1.2 模型制作

經典的Marmarou 模型是最常用的彌漫性腦損傷動物模型之一，在本次實驗中參考韋恩州立大學（Wayne state university，WSU）改進的Marmarou 撞擊加速度模型[9]，并在實驗室搭建，以測量大鼠頭部在撞擊過程中的實時機械損傷和反應。操作如下：SD 大鼠編號稱重之后，所有大鼠均用0.4%戊巴比妥鈉（40 mg?kg-1）腹腔注射麻醉。麻醉完成后，給大鼠在顱骨頂端戴上規格為直徑10 mm、厚度3 mm 的金屬圓鐵片，將大鼠俯臥位固定于已知彈性系數的聚氨酯泡沫上，使用同一450 g 重量的砝碼分別從1.25 m 和2.25 m高處自由落體垂直打擊，打擊后立刻移開聚氨酯泡沫以免砝碼誤傷，并立刻對大鼠進行過量麻醉致死，取大鼠腦干部分用4%多聚甲醛固定24～48 h。正常對照組不作任何操作而直接過量麻醉致死取材。

1.3 HE 染色

將固定好的組織剝離小腦，用梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片（厚度7 μm）、梯度乙醇脫臘到水，蘇木素-伊紅染色，脫水封片，電子顯微鏡下觀察。為了盡可能準確統計大鼠腦干及錐體束出血程度，在切片過程中，取距延髓-脊髓交界處2 mm 計作a 位置，再后移1.5 mm 和3 mm 計作b、c 位置冠狀切面取材。利用Olympus正置熒光顯微鏡采像系統拍攝HE 切片中大鼠腦干和錐體束區域，在10×100 倍視野下每張片子隨機選取4 個視野，依次對切片觀察采像。計算各組在腦干區域的細胞水腫個數，每見1 處計數1。在Image J 1.53 系統軟件中對每張片子進行圖像處理，手動勾畫出血部分區域進行百分比計算。

1.4 免疫組織化學染色

兔抗鼠β-APP 單克隆抗體購于武漢博士德生物工程公司，免疫組織化學染色試劑盒均購于北京博奧森生物技術有限公司。按照說明書的染色方法對大鼠腦干b 位置切片進行染色觀察。在滴加封閉血清和一抗前需進行檸檬酸緩沖液高溫抗原修復，其中一抗的濃度為500 μg?mL-1，按照1:250 的稀釋比例進行稀釋，并設置空白及陰性對照。對β-APP 免疫組化染色結果在光鏡下400 倍，取腦干區4 個面積均為0.48 mm2的不重復視野，用Image J 1.53 系統軟件測量計算陽性細胞面積和累積光密度值（Integral optical density，IOD）。

1.5 實驗數據統計處理方法

完成數據采集后采用SPSS 26、Graphpad Prism 8.0 統計分析軟件對數據進行統計分析處理。計量資料以均數±標準差（）表示，采用雙因素方差分析；計數資料以例數（%）表示，采用相關性檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肉眼觀察

實驗組大鼠使用0.4%戊巴比妥鈉（40 mg?kg-1）進行過量麻醉處死后，取全腦進行腦表面及冠狀切片檢查，不同致傷高度組大鼠腦干位置均可見血管擴張淤血，對照組大鼠腦干表面未見明顯淤血。

2.2 HE 染色觀察

大鼠腦干組織經石蠟切片HE 染色后，光鏡下正常對照組的大鼠腦干結構清晰完整，神經束排列整齊，細胞周圍間隙致密，出血量少，偶有出血點，常呈分散點狀，見圖1A～1C 中正常組大鼠腦干切片；同一大鼠的腦干a、b、c 位置之間的切片區別不是非常明顯，相對比之下，在c 位置的出血點數量多于a、b 位置的切片。

致傷組可見錐體束及腦干部位出現神經束疏松、紊亂、血管淤滯，胞核皺縮或溶解、破裂，出現細胞外間隙擴大，腦細胞體檢增大的腦水腫現象，神經元及微血管周隙呈海綿狀或空泡樣，見圖1D～1F 中1.25 m 致傷組大鼠腦干切片。對比正常對照組，1.25 m 損傷組內，出血點呈分散點狀和長條型出血混合，出現血管源性水腫。在2.25 m 損傷組內，出血點以長條型出血居多，且常見淤血，神經細胞周圍間隙擴大。腦水腫個數增加，出現血管源性腦水腫和細胞毒性腦水腫，多見血管源性腦水腫。對比正常組和1.25 m 致傷組同一位置切片，可見出血面積明顯密集且增加，同一損傷大鼠的腦干a、b、c 位置切片的出血量呈逐步上升趨勢，見圖1G～1I 為2.25 m 致傷組大鼠腦干切片。

為了更好的觀察對比不同致傷高度下大鼠腦干區域和錐體束區域出血量和腦細胞水腫個數的變化，我們通過Image J 1.53 軟件對各組大鼠腦干和錐體束出血面積占比進行計算，再采用IBM SPSS Statistics 26、Graphpad Prism 8.0 統計分析軟件對數據進行統計分析處理，結果如圖1J～1O 所示。在圖1J、1L、1N 中，可以觀察到隨著致傷高度的增加，在腦干和錐體束位置的損傷也逐步加深；雙因素方差分析結果發現，不同致傷高度對腦干區域出血面積占比、腦水腫個數和錐體束出血面積占比的影響存在明顯差異（P＜0.01）；而在圖1K、1M、1O 中可以發現，腦干區域出血面積占比和錐體束出血面積占比隨著切片位置越接近腦干而越大，而腦水腫數量則無此變化；雙因素方差分析結果也發現切片部位距腦干遠近的不同對腦干區域出血面積占比和錐體束出血面積占比的影響存在明顯差異（P＜0.01），而對腦水腫數量不存在明顯差異（P＞0.01）。

2.3 免疫組織化學染色觀察

經過對大鼠腦干HE 染色a、b、c 位置的觀察，我們發現在b 位置進行實驗觀察的效果最為穩定，因此在對大鼠腦干β-APP 免疫組化實驗中，我們集中選擇了b 位置進行實驗。正常對照組腦干區域神經細胞胞漿及細小血管周圍偶見β-APP染色呈弱陽性反應，不同致傷高度分組在光鏡下腦干區域神經細胞胞漿及細小血管周圍β-APP 染色棕色陽性增強，并且范圍逐步擴大，見圖2A、2C、2E。在1.25m 致傷組可在腦干區域偶見軸索損傷，開始出現β-APP 陽性棕色顆粒分布。在2.25m 致傷組可在腦干區域見到輕度軸索腫脹、斷裂、扭曲變形、末端膨大等，在腦干中線周圍分布的β-APP 陽性細胞面積明顯增多。

觀察β-APP 在錐體束區域的變化發現，隨著致傷強度的增加，β-APP 染色的陽性表達增強，軸索病理改變更明顯，見圖2B、2D、2F。通過Image J 1.53 軟件對大鼠腦干β-APP 免疫組化染色進行讀取，計算β-APP 陽性細胞面積IOD 值，發現0 m 正常組的IOD 值為0.15±0.12，而1.25 m和2.25 m致傷實驗組的IOD值分別為0.51±0.24和1.03±0.23。隨著致傷程度的加深，β-APP 陽性細胞面積及IOD 值呈持續升高（P＜0.05）。

2.4 數據相關性分析

為了分析不同損傷程度腦組織切片的HE 染色分析與β-APP 免疫組化染色的相關性，我們選取了腦干相同位置的HE 染色數據和β-APP 免疫組織化學檢測數據做相關性分析，見表1。正常組和致傷組大鼠腦干組織切片感興趣區域內測定的β-APP 的陽性細胞面積和IOD 值與HE 染色的腦干區域的出血面積占比和錐體束出血面積占比呈正相關。

表1 不同致傷高度下大鼠腦干b 位置腦干出血占比、腦水腫個數、錐體束出血占比和陽性細胞面積、IOD 值的皮爾遜相關性分析

3 討論

DAI 是一種常見的腦損傷，目前認為DAI 的發生機制是由于交通事故、高墜或暴力作用于頭部產生角加速度，在腦組織內引起剪切作用，使神經纖維斷裂，形成原發性軸索損傷所致。DAI 的形成涉及一系列病理生理學變化過程[16]，腦損傷后血管網損傷、Ca2+超載、線粒體損傷、軸索結構損傷、軸索轉運障礙、繼發性缺血缺氧、水腫、炎性反應、自由基、膠質細胞反應性增生等病理生理學反應不僅可加重軸索損傷，且對DAI 的發展及轉歸也起重要作用。DAI 可單獨導致死亡，并作為損傷致死的診斷依據[17]，而在實際案例中，DAI 的發生常常還伴隨著其他相關重型腦損傷。因此，研究原發性DAI 損傷是具有醫學病理實際意義的。Marmarou 模型可穩定、可靠地復制大鼠DAI 模型。本實驗參考美國韋恩州立大學改進的Marmarou 模型[9]，自制DAI 動物實驗裝置，可較為理想地建立不同損傷高度的DAI 動物模型。

β-APP 是一種廣泛存在于全身組織[18]，具有膜受體蛋白樣結構的大分子膜糖蛋白，正常腦組織其表達水平很低而不易被檢測。Smith 等研究表明[19]，DAI 后，受損的軸索可能是β-APP 的儲存器，并且它可以釋放到周圍腦實質。Ekmark-Lewen 等研究也發現DAI 發生后β-APP 在腦組織中的含量顯著升高[20]。在腦組織力學損傷作用下，軸索受損后發生軸漿運輸障礙，引起β-APP 在損傷部位異常聚集、表達上調，損傷早期可發現β-APP 在軸索內積聚，逐步增強，且具有一定的時空性，是軸索損傷的主要機制和重要病理標志，β-APP 陽性染色軸索的數量和含量與損傷程度、時間長短、動物年齡及代謝狀態都密切相關。因此β-APP 常被作為檢測軸索損傷的標志物[19]，對軸索損傷有很好的提示作用。Reichard 等應用β-APP 評估非事故性中樞神經系統損傷（Nonaccidental central nervous system injury，NAI）[21],對28 例NAI 患者研究發現，27 例患者出現軸索β-APP 陽性染色。22 例系繼發于腦水腫及血管收縮引起的供血不足，稱為血管性軸索損傷（Vascular axonal injury，VAI），19 例為DAI，16例同時存在VAI 和DAI，表明缺血也是軸索損傷的一個重要原因。

在道路交通事故或高墜所致的顱腦損傷中，腦干是腦損傷的好發部位。腦干自下而上由中腦、腦橋、延髓三部分組成[22]，是大腦、小腦與脊髓相互聯系的重要通路。Marmarou 模型造成的腦干軸索損傷主要集中于腦干縱行纖維束包括錐體束、內側縱束等[15]。錐體束行經腦干腹側面，是大腦皮層下行控制軀體運動的最直接通路[23]，其功能主要是發動和管理骨骼肌的運動。在發生腦損傷時，腦干發生損傷使錐體束受累，則必然會引起在錐體束組織內一系列的病生理變化，伴隨著出現出血、水腫、神經束紊亂等現象。大腦中水的分布非常廣泛，包括腦脊液、血液、細胞內液、組織液等，由于滲透壓和細胞內外電解質的不同，細胞、腦室和細胞間隙的液體交換對保持腦組織正常功能有重要作用[24]。有學者將由脈管系統、神經元、星形膠質細胞組成的神經血管網絡命名為“腦類淋巴系統”[25]，它們通過多種通路調控神經膠質和血管之間的水分子運動，對調控水分子的正常分布至關重要。

但是既往研究未見涉及錐體束出血面積占比和β-APP 在不同程度DAI 損傷后的定量變化及其相關性分析。正是基于此，本文通過HE 染色定量測量了腦干感興趣區域的出血面積占比和錐體束區域的出血面積占比，計量了腦干感興趣區域的腦水腫個數，并且在腦干延髓位置選取自下而上的a、b、c 三個位置。定量計算后的結果顯示，隨著腦干位置越接近大腦的位置，腦干和錐體束區域在不同程度的致傷后出血面積占比越高，而腦水腫個數和腦干位置沒有明顯關系；隨著腦干致傷程度的加深，腦干區域的平均出血面積占比、平均腦水腫個數和平均錐體束出血面積占比均持續上升，且差異顯著。隨后，結合β-APP 免疫組織化學實驗，在2.25 m 致傷組中可以觀察到輕度的典型DAI 軸索損傷改變，證明在本實驗條件下該模型穩定、可靠。分析測量的陽性細胞面積和IOD 值可以發現HE 染色中腦干和錐體束位置的出血面積占比變化與β-APP 陽性細胞面積和IOD 值隨致傷程度變化的趨勢相對應，且互相之間呈正相關，說明HE 染色中的出血面積占比變化對于判斷評價大鼠腦干原發性功能損傷程度具有一定的可行性。

本課題以大鼠腦干原發性DAI 為基礎，結合HE 染色和β-APP 免疫組化實驗，為定量研究神經功能損傷程度提供了新的思路方法。β-APP 常被作為檢測DAI 損傷的標志物，本實驗采用雙盲法，通過β-APP 陽性細胞面積和IOD 值評價腦干損傷的嚴重程度具有準確性，后續研究還需要進一步增加動物數量，探究β-APP 蛋白的分布位置對評估腦損傷嚴重程度是否有相關性。