馬鈴薯試管薯誘導培養基及誘導技術改良研究

許 杰，生兆平，夏印文

（1.山東省棗莊市農業科學研究院，山東棗莊 277800；2.山東省棗莊市山亭區北莊鎮農業綜合服務中心，山東棗莊 277218；3.山東省棗莊高新技術產業開發區興仁街道辦事處，山東棗莊 277800）

馬鈴薯種植范圍廣，魯南地區是典型的馬鈴薯二季作區。棗莊市目前已發展成為全國最大、單產最高的二季作馬鈴薯代表性產區，截止到2021 年底，全市馬鈴薯栽培面積已發展到5 萬hm2，總產值超過160 億元[1]。

馬鈴薯連作障害導致病害發生嚴重，馬鈴薯本身容易產生各類病害問題，做好病害防治工作，確保產業推進是后續工作的重點和難點[2]。目前，解決馬鈴薯病害的主要方法是普及馬鈴薯脫毒種薯全覆蓋，防止種薯帶菌，隨著馬鈴薯脫毒技術的引進和脫毒種薯的大量使用，馬鈴薯產業發展迅速，從而帶動了馬鈴薯脫毒種薯技術的快速發展[3]。利用馬鈴薯脫毒試管薯播種在基質中繁育馬鈴薯脫毒原原種的方法優勢明顯，馬鈴薯苗成活率高，植株生長旺盛，而且，脫毒試管薯擁有種性好、體積小、質量輕、品質優、休眠期長、繁殖快的優點，同時，又為馬鈴薯種質資源的保存、交換、運輸提供便利[4]。有關馬鈴薯脫毒試管薯誘導的研究報道中，張艷萍等[5]認為適合馬鈴薯試管薯誘導的培養基為MS 液體培養基或固液雙層培養基。張天宇等[6]指出在8%蔗糖濃度下，液態+濾紙培養基與固態培養基對結薯率、薯塊直徑的影響差異不大。歐建龍等[7]報道適合試管薯誘導的培養基中蔗糖濃度為8%。楊莎等[8]試驗表明含8%蔗糖的培養基試管薯誘導率遠遠高于含3%蔗糖的。本實驗在前人研究成果的基礎上以‘魯引一號’為材料，改良了組培苗壯苗培養基配方和組培苗誘導試管薯的暗培養技術，以期找到提高試管薯產量和質量的最佳培養條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

馬鈴薯品種為‘魯引一號’脫毒種薯，由山東省農業科學研究院提供。

活性炭，上海樂康活性炭有限公司。

蔗糖，食品級，蘇州市邦卓精細化工有限公司。

椰子汁，海南椰樹牌椰汁。

1.2 試驗方法

基礎培養基為MS 培養基，添加各種成分激素、蔗糖、活性炭、椰子汁等，加6 g/L 瓊脂粉，分裝組培瓶中，每瓶50 mL，高壓滅菌鍋中120 ℃濕熱滅菌20 min，備用。

暗培養方式：組培苗經過壯苗培養，將組培瓶放入紙箱中，用覆蓋透光率80%遮陽網進行暗培養。

1.2.1 馬鈴薯莖尖的剝離

用3 mg/L 赤霉素浸種8 min，將浸種后的馬鈴薯種薯沙培催芽，待芽長3 cm 左右，取出，沖洗干凈備用。取芽尖1 cm 左右，自來水沖洗30 min，紗布擦干水，于超凈工作臺上，培養皿中75%酒精滅菌30s，0.1%升汞滅菌5min，無菌水沖洗5 次，無菌濾紙濾干水，解剖鏡下進行莖尖剝離，取莖尖分生組織0.3 mm，放于滅菌過的培養基中進行馬鈴薯組培苗誘導[9]。

1.2.2 馬鈴薯脫毒苗的誘導

為兼顧馬鈴薯分生組織誘導組培苗的效果和成本，選擇MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L 為馬鈴薯分生組織誘導組培苗的培養基配方。將莖尖分生組織放于滅過菌的培養基中于無菌培養室內培養，溫度25 ℃，光照12h，光照強度2000 lx。誘導出馬鈴薯組培苗，待苗高5 cm以上時，可以進行馬鈴薯組培苗的病毒檢測，經過病毒檢測獲得馬鈴薯脫毒苗[10]。

1.2.3 馬鈴薯脫毒苗的病毒檢測

對組培苗進行病毒檢測是培育脫毒苗的關鍵環節。目前，常用試劑條檢測法。具體步驟為將要檢測病毒的組培苗碾磨成汁液，將試劑條放入汁液中，檢測是否有病毒，將帶病毒的組培苗去除，經過篩選，獲得脫毒組培苗備用[11]。

1.2.4 脫毒苗的快速繁育技術

無病毒的馬鈴薯組培苗可以用于大量繁育馬鈴薯脫毒苗。在無菌條件下，將待繁的脫毒苗一葉一節切段，扦插于1/2 MS 培養基中，3 d 以后，50%的切段萌根，5 d 以后全部生根，3～5 d 腋芽萌發，30 d 左右長成5～7 片葉的組培苗，可再進行循環繁殖[12]。

1.2.5 馬鈴薯脫毒組培苗壯苗培養

暗培養的植株，在遮光的條件下生長，不能進行光合作用，全靠試管苗本身儲存的養分轉化成小塊莖。因此，壯苗培養是試管薯誘導的必要前提。將脫毒苗切去頂部和基部，把長到3～4 節的莖段放入液體培養基中培養，每瓶放入10 個莖段。常規液體壯苗培養基為MS+蔗糖30 g/L+活性炭5 g/L，改良壯苗培養基為MS 基礎培養基，加入各蔗糖、椰子汁、活性炭配比，具體見表1。在組培瓶中作淺層液體靜止培養。培養室的溫度為25 ℃，每日光照16 h，光照強度在2 000 lx 以上，莖段培養5 d 即有腋芽萌出，30 d 瓶內長滿小苗，即可轉入暗培養誘導試管薯[13]。

表1 不同濃度原料對馬鈴薯組培苗壯苗培養的影響Table 1 Effects of different concentrations of raw materials on the strong seedling culture of potato tissue culture seedlings

1.2.6 壯苗暗培養誘導試管薯

將不同培養基培養出的馬鈴薯脫毒壯苗，進行暗培養，常規方法是一直暗培養60 d，然后收獲馬鈴薯試管薯。改良后暗培養方法是將馬鈴薯脫毒壯苗暗培養10 d，散射光培養10 d，然后繼續暗培養，直到60 d 收獲[14]。

1.3 主要觀察記載項目

不同壯苗培養基，培養馬鈴薯30 d 后，利用游標卡尺測量馬鈴薯組培苗的莖粗，以毫米為計量單位；利用拍照式葉面積儀測量葉面積，以平方毫米為單位，取平均值比較。

暗培養30 d 后，記錄每瓶誘導出的試管薯數量，以個為計量單位；暗培養60 d 后收獲，記錄試管薯單薯平均質量，以毫克為計量單位。單薯質量增減變化計算公式見式（1）。

1.4 儀器

YMJ-P1 拍照式葉面積儀，山東恒美電子科技有限公司；標康SL01-1 高精度電子數顯游標卡尺。

1.5 統計方法

用Excel 2010 版本進行數據分析和處理。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯脫毒組培苗壯苗培養結果

由表1 可知，增加活性炭、蔗糖、椰子汁的量，可以較明顯增加馬鈴薯組培苗的莖粗及葉面積，培養基配方MS+活性炭15 g/L+蔗糖100 g/L+椰子汁100 mL/L 培養的馬鈴薯組培苗平均莖粗最粗、平均葉面積最大，莖粗達到2.1 mm，平均葉面積達到46 mm2，較常規培養基配方MS+蔗糖30 g/L+活性炭5 g/L 培養的馬鈴薯組培苗莖粗增加75%，葉面積增加84%。其它培養基配方培養的馬鈴薯組培苗較常規培養基配方培養的組培苗在組培苗莖粗和葉面積上均有明顯增加，培養基配方MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L 培養的馬鈴薯組培苗，莖粗為1.7 mm，葉面積為40 mm2，較常規培養基配方培養的馬鈴薯組培苗莖粗增加了42%，葉面積增加了60%。

綜合成本及實際應用效果，最終選擇MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L 培養基配方進行壯苗培養。

2.2 馬鈴薯脫毒組培苗壯苗暗培養誘導試管薯結果

由表2 可知，改良暗培養方式及改良配方，可明顯增加馬鈴薯試管薯平均單株結薯個數和平均單薯質量，平均單薯質量與常規方式差異極顯著，改良暗培養方式比常規培養方式誘導的試管薯平均單株結薯個數增加35.8%，改良培養基配方較常規培養基配方誘導的試管薯平均單株結薯個數增加27.3%；改良暗培養方式比常規培養方式誘導的試管薯平均單薯質量增加9.3%，改良培養基配方較常規培養基配方誘導的試管薯平均單薯質量增加10.9%。因此，暗培養方式改良后大幅度增加了馬鈴薯試管薯單株結薯個數，而培養基配方的改良可以有效增加馬鈴薯試管薯單薯質量。

表2 不同的暗培養方式對馬鈴薯試管薯的影響Table 2 Effects of different dark culture methods on potatoes in vitro

3 小結

試驗將常規培養基配方MS+蔗糖30g/L+活性炭5g/L改良為MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L，將常規的一直暗培養方式改良為暗培養10 d，散射光培養10 d，然后再暗培養。試驗結果表明，改良后馬鈴薯試管薯平均單株結薯4.2 個，比常規培養增加35.8%，改良后馬鈴薯試管薯平均單薯質量319 mg，比常規培養增加10.9%。

馬鈴薯種薯繁育時，由于地塊、環境、蚜蟲的影響，致使脫毒種薯退化嚴重，由于脫毒品種檢測手段、檢測標準普及率低，致使部分馬鈴薯種子質量較差，給農民帶來巨大的經濟損失。因而，選用高質量的脫毒種薯用于大田生產以及保持脫毒微型薯種性不退化是提高馬鈴薯產量水平的最簡捷、快速的有效途徑。而試管薯體積小，無病原，儲藏、運輸方便，并克服了試管苗移栽成活率差，以及剪尖扦插易污染等一系列的問題，對于加速脫毒種薯在生產上的應用非常有利，但是，利用組培苗進行試管薯誘導難度較大，產量也不高，試管薯個頭小，播種后成活率有一定的影響[15]。

下一步，本課題組將會繼續改進馬鈴薯試管薯誘導培養基及誘導方法，并試驗利用500 mL 組培瓶進行馬鈴薯小微型薯組培瓶內生產，即在500 mL 組培瓶內放入栽培基質，如蛭石等，然后將馬鈴薯組培苗切段栽插在組培瓶內，在基質中生產小微型薯，用以提供成活率和質量。