花生油脂合成相關(guān)酰基轉(zhuǎn)移酶基因的研究進展

沈悅　沈一　劉永惠　梁滿　張旭堯　陳志德

摘要：花生是重要的油料作物和經(jīng)濟作物，我國花生年產(chǎn)量居世界第一，居國內(nèi)油料作物首位，其總產(chǎn)的50%以上均用于榨油。囿于國內(nèi)糧油爭地矛盾和不斷增長的油脂消費需求等因素，提高油料作物含油量對保障我國食用油脂安全具有重要的戰(zhàn)略意義。花生種子油脂的主要成分為三酰甘油（TAG），其合成受到多個限速酶基因的協(xié)同調(diào)控，這些基因的時空表達特性、脂肪酸底物選擇性和非生物脅迫響應(yīng)等機制與油脂積累密切相關(guān)，最終影響油籽的產(chǎn)量和品質(zhì)形成。植物油脂合成是涉及多個亞細胞區(qū)室、多條合成途徑調(diào)控的復雜代謝網(wǎng)絡(luò)，本文在總結(jié)植物油脂區(qū)室化合成步驟的基礎(chǔ)上，對花生油脂的功能特性以及花生油脂合成途徑中相關(guān)關(guān)鍵酰基轉(zhuǎn)移酶的作用機制和研究現(xiàn)狀進行歸納闡述，并提出存在的問題和建議，為花生油脂性狀的精準鑒定和遺傳育種提供參考。

關(guān)鍵詞：花生；油脂合成途徑；三酰甘油；酰基轉(zhuǎn)移酶

中圖分類號：S565.201 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0065-06

花生（Arachis hypogaea L.）別稱落花生，豆科植物，異源四倍體（AABB，2n=4x=40），為近緣二倍體野生種蔓花生（Arachis duranensis）和Arachis ipaensis單一雜交后經(jīng)染色體自然加倍馴化而來［1］。花生是我國主要的油料作物和經(jīng)濟作物之一，其種植面積長期居于國內(nèi)油料作物第二、總產(chǎn)第一水平，在保障我國食用油脂安全方面具有重要的戰(zhàn)略地位［2］。花生籽仁富含超過50%的粗脂肪，不飽和脂肪酸含量占比80%以上，是優(yōu)質(zhì)食用植物油的重要原料［3-4］。近年我國國產(chǎn)食用植物油自給率僅在1/3左右［5］，而花生進出口貿(mào)易自2019年開始呈凈進口態(tài)勢［6］，其國際市場競爭力已然面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，囿于國內(nèi)糧油爭地和農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，以市場需求為驅(qū)動力，如何提高花生油脂含量和品質(zhì)，高效、定向培育耐儲存油用型的花生新品種成為當前花生育種的重要目標之一。

植物油脂屬于甘油脂類中性貯藏脂，通常以三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的形式廣泛存在于種子、花粉和一些肉質(zhì)果（如油棕櫚、橄欖等）組織中，常見用于食品、飼料和工業(yè)等。植物中存在多條油脂合成獨立途徑，其中包括簡單的依賴酰基輔酶A的Kennedy途徑（從頭合成DAG/TAG）和復雜的不依賴酰基輔酶A的PC途徑（PC衍生的DAG/TAG），這2條途徑的選擇偏好及TAG合成相對通量存在一定的種間差異和組織特異性［7-9］。因此，闡明植物油脂生物合成途徑及其關(guān)鍵酶基因的遺傳學研究進展，對花生油脂性狀的功能鑒定和育種利用具有重要意義。

1 植物油脂生物合成途徑

植物油脂合成是一個涉及多個亞細胞區(qū)室、多條合成途徑協(xié)同完成的生化反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)，通常分為3個階段：首先，在質(zhì)體中進行脂肪酸的從頭合成、去飽和，并被外運到細胞質(zhì)；其次，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行脂肪酸修飾，然后通過Kennedy途徑（或PC途徑）組裝TAG（圖1）；最后TAG在油體（或脂滴）中穩(wěn)定儲存。基于植物油脂代謝網(wǎng)絡(luò)的復雜性，質(zhì)體輸出脂肪酸的相對通量、脂肪酸鏈的延長、酰基編輯、脂肪酸修飾以及TAG組裝酶的有效通量等都會影響組織TAG積累及其脂肪酸組成多樣性［10］。

1.1 脂肪酸從頭合成途徑

脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）從頭合成以糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸為前體，經(jīng)丙酮酸脫氫酶（pyruvatedehydrogenase，PDH）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）脫氫、羧化，生成的丙二酰輔酶A在脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）催化下在酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）上進行酰基鏈的組裝，每循環(huán)延長2個碳鏈，經(jīng)7個循環(huán)反應(yīng)生成飽和的16：0-ACP，隨后被酮酰-ACP合成酶Ⅱ（ketoacyl-ACP synthase，KAS）延長C16酰基鏈生成飽和18：0-ACP，再被硬脂酰-ACP脫飽和酶（stearoyl-ACP desaturase，SAD）去飽和生成18：1-ACP。2種脂肪酸硫酯酶（fatty acid thioesterase，F(xiàn)ATA/FATB）分別水解上述不飽和/飽和中間產(chǎn)物，釋放游離FAs（18：1Δ9>[KG-*2]>16：0>18：0）［9，11-12］。

3種游離FAs被長鏈酰基輔酶A合成酶（long-chain acyl-CoA synthetase，LACS）轉(zhuǎn)化為酰基輔酶A（acyl-coenzyme A，Acyl-CoA），并被脂肪酸外運蛋白（fatty acid export，F(xiàn)AX）輸出質(zhì)體，生成Acyl-CoA庫（18：1-CoA、18：0-CoA和16：0-CoA）用于下游脂肪酸鏈延長、修飾和TAG組裝等過程［13-14］。不難看出，脂肪酸合成存在多個限速步驟，該途徑?jīng)Q定了碳鏈的長度（最多18個）以及植物油中飽和脂肪酸的水平。

1.2 Kennedy途徑（DAG/TAG從頭合成）

以甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P）為酰基受體、Acyl-CoA為酰基供體，經(jīng)酰基輔酶A：甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl-CoA：glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）和酰基輔酶A：溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl-CoA：lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT）在G3P的sn-1和sn-2位進行2次順序酰化生成磷脂酸（phosphatidic acid，PA），PA經(jīng)磷脂酸磷酸酶（phosphatidic acid phosphatase，PAP）水解去除磷酸鹽，生成的二酰甘油（diacylglycerol，DAG）經(jīng)酰基輔酶A：二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl-CoA：diacylglycerol acyltransferase，DGAT）在底物DAG的sn-3位進行第3次酰化生成TAG［8，11］，這種G3P與Acyl-CoA經(jīng)3次順序酰化生成從頭DAG/TAG的過程被稱為Kennedy途徑。除了直接利用質(zhì)體輸出的Acyl-CoA，從頭合成DAG/TAG合成途徑還可以利用細胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中延長到≥20個碳的Acyl-CoA。

1.3 PC途徑（PC衍生的DAG/TAG合成）

磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）既是用于FA修飾的位點，也是用于TAG合成的新DAG底物的中間體，表明PC衍生的DAG/TAG途徑是增加TAG中不飽和或獨特（unusual）脂肪酸的一種重要方式。PC從頭合成需要產(chǎn)生2次DAG：首先從頭合成DAG，隨后轉(zhuǎn)化為PC，最后釋放新的DAG。這一過程中從頭DAG被導入PC后先進行FA修飾，再從PC釋放含有修飾FA的DAG，因此，不難發(fā)現(xiàn)從頭合成的DAG和PC衍生的DAG之間是明顯不同的分子類型。共存在3種酶促途徑合成PC衍生的DAG：（1）利用CDP-膽堿：二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶（CDP-choline：DAG cholinephosphotransferase，CPT）反向介導PC和DAG相互轉(zhuǎn)化［12］；（2）利用磷脂酰膽堿：二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶（phosphatidylcholine：diacylglycerol cholinephosphotransferase，PDCT）介導PC和DAG相互轉(zhuǎn)化［15］；（3）基于脂肪酶介導的途徑，如磷脂酶C（phospholipase C，PLC）或PLD/PAP催化水解PC生成DAG［16］。

1.4 酰基編輯

酰基編輯是一個去酰化-再酰化循環(huán)反應(yīng)，該循環(huán)始于PC釋放酰基，通過酰基輔酶A：溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl-CoA：lyso-phosphatidylcholine acyltransferase，LPCAT）的反向反應(yīng)生成溶血磷脂酰膽堿（lyso-PC/LPC），LPCAT再重新酯化LPC生成PC完成循環(huán)［17］。酰基編輯本身不影響PC和TAG凈積累，它允許PC和Acyl-CoA庫之間完成快速的酰基交換，可以源源不斷地為從頭合成DAG/TAG提供PC修飾的新生FAs。

2 花生油脂功能特性

花生油脂具有特異的脂肪酸組成，主要包括棕櫚酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）、亞油酸（C18：2）、亞麻酸（C18：3）、花生酸（C20：0）、花生烯酸（C20：1）、山崳酸（C22：0）、二十四碳烷酸（C24：0）等長鏈脂肪酸，其中油酸相對含量最高（34%～68%），亞油酸次之（19%～43%），總不飽和脂肪酸含量超過80%。油酸具有較好的熱穩(wěn)定性和抗氧化性，提高油酸含量利于促進花生油脂及相關(guān)加工產(chǎn)品的耐儲藏性。在對人體血管穩(wěn)態(tài)保健方面，油酸可以靶向降低低密度脂蛋白膽固醇，亞油酸作為人體必需脂肪酸，也能夠降低人體總膽固醇、預防高血壓和動脈粥樣硬化，但因其不飽和程度較高極易氧化酸敗［18］。含油率和油亞比是評估花生油脂供給能力和品質(zhì)價值的重要指標。有關(guān)研究表明，花生含油量每提高1%，相當于產(chǎn)量提高2%，油脂加工利潤相應(yīng)提高7%［19-20］；油酸、亞油酸含量遺傳主要受加性效應(yīng)控制，并且兩者之間存在顯著負相關(guān)［21］；另外，花生含油量與油酸、亞油酸含量之間不存在顯著相關(guān)性［22-23］，這些結(jié)論有效支撐了當前育種工作者對于專用型花生品種（如高油兼高油酸）定向培育的可行性。

3 三酰甘油合成相關(guān)酰基轉(zhuǎn)移酶研究進展

3.1 甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（GPAT）

GPAT主要催化Acyl-CoA上的酰基向G3P羥基位轉(zhuǎn)移，生成溶血磷脂酸（lyso-phosphatidic acid，LPA）。G3P作為合成TAG的碳鏈骨架，存在3個脂肪酸結(jié)合位點sn-1、sn-2和sn-3。迄今發(fā)現(xiàn)10個擬南芥GPAT同系物，其中GPAT1-8為陸生植物特有的sn-2-GPAT，主要參與角質(zhì)、軟木脂等極性甘油脂合成，暫無證據(jù)表明與油脂合成相關(guān)［24-25］；GPAT9與動物脂肪合成基因GPAT3/4高度同源，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的sn-1位雙功能酶基因直接參與植物膜脂和TAG的生物合成［26］。此外，質(zhì)體定位的ATS1可利用acyl-ACP為酰基供體催化G3P的sn-1位脂酰化，可能與植物耐寒應(yīng)答機制相關(guān)［27-28］。花生組織qRT-PCR時空表達分析結(jié)果顯示，AhGAPT1、AhGAPT2、AhGAPT6、AhGAPT8和AhATS1主要在葉片和花中的表達量較高，AhGAPT3和AhGPAT5主要在花生種子發(fā)育初期下胚軸中表達量較高，AhGPAT9主要在莖、花和種子中表達并且種子表達量與種子油脂積累速率呈正相關(guān)，這些基因均可能參與（或部分參與）了植物對低溫、高鹽、脫落酸（ABA）等的非生物脅迫應(yīng)答［29-31］。比較發(fā)現(xiàn)，AtGPAT9和AhGPAT9具有高度的序列相似性，過表達AtGPAT9導致擬南芥種子質(zhì)量、面積和含油量均上調(diào)，并且atgpat9突變體呈雌雄配子體純合致死表型；過表達AhGPAT9也導致轉(zhuǎn)基因花生種子含油量顯著增加，沉默表達株系中表現(xiàn)為降低，不難看出AhGPAT9在植物油脂合成中與AtGPAT9一樣具有相似的功能。此外，AhGPAT9等位基因多態(tài)性高油位點雜交組合也為花生高油育種提供了新思路［31-32］。

3.2 溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶（LPAAT）

LPAAT（或LPAT）負責催化LPA和Acyl-CoA酯化生成磷脂酸（PA）。PA是膜脂、信號和貯存脂類生物合成的關(guān)鍵中間體，LPAAT通過調(diào)控LPA在不同組織中轉(zhuǎn)化為不同PA來調(diào)控生物體細胞功能。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育和底物選擇性分為4個亞組，包括LPAAT1、LPAAT2/3（A-class LPAAT）、LPAATB（B-class LPAAT）和LPAAT4/5。目前報道了5個擬南芥LPAAT同系物，質(zhì)體定位的AtLPAAT1能夠在各組織中廣泛表達，該基因?qū)︴；孜锏倪x擇性更傾向于16：0-CoA，功能缺失突變體中質(zhì)體PA合成被阻斷，導致純合突變株種子的胚胎在心形—魚雷階段停止發(fā)育而死亡［33-34］。LPAAT2/3亞組對酰基底物的選擇性更傾向于18：1-CoA，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的AtLPAT2也能夠在各組織中廣泛表達，突變后導致雌配子體敗育；AtLPAT3主要在花粉中表達且活性高于AtLPAT2，兩者存在一定的功能冗余［35］。LPAATB亞組在底物選擇性上傾向于中鏈脂肪酰基（12：0～16：0-CoA），擬南芥中暫無相關(guān)報道。LPAAT4/5亞組進化上與動物AGPAT8接近，AtLPAT4和AtLPAT5能在擬南芥各組織中廣泛表達但豐度較低［35］，并且這2個基因存在不同的轉(zhuǎn)錄本（TAIR），功能未知，表明植物PA合成的復雜程度遠超出目前的認知。

花生組織qRT-PCR時空表達分析結(jié)果顯示，AhLPAAT2主要在花生種子中高豐度表達，AhLPAAT4、AhLPAAT5、AhLPAAT6等3個基因在花中的轉(zhuǎn)錄豐度高于其他組織，4個基因的轉(zhuǎn)錄水平受非生物脅迫（低溫、鹽、干旱和ABA）差異誘導［36］。AhLPAT2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其種子表達量與籽仁油脂積累速率變化一致，高油品種的AhLPAT2種子表達量始終高于低油品種；擬南芥中過表達AhLPAT2能夠促進組織內(nèi)脂肪酸從頭合成、TAG組裝、蔗糖代謝和糖酵解途徑相關(guān)幾個關(guān)鍵基因的誘導表達，導致轉(zhuǎn)基因株系種子的含油量、粒質(zhì)量均顯著增加［37-38］。AhLPAT4定位于細胞質(zhì)，該基因在花生種子的不同發(fā)育階段的表達量與油脂積累速率不一致［39］。不難看出，花生AhLPAATs家族成員在組織和亞細胞中的表達存在明顯的時空差異性，意味著其參與了體內(nèi)多種脂代謝功能，它們對油脂合成及其組分多樣性的貢獻有待進一步研究。

3.3 二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）

DGAT是催化Acyl-CoA依賴的TAG從頭合成途徑的最后一步限速酶，系統(tǒng)發(fā)育進化分析劃為4類：DGAT1、DGAT2、可溶性DGAT以及細菌WS/DGAT，其中DGAT1和DGAT2在真核生物中廣泛存在。目前，AtDGAT1是唯一被證實與擬南芥種子TAG合成和積累直接相關(guān)的，該基因功能缺失后能導致種子含油量減少20%～40%，某種程度上也表明TAG合成存在其他途徑的補償機制；同時，AtDGAT1還能介導植物對低溫脅迫的應(yīng)答［40-42］。擬南芥中AtDGAT2可能不編碼功能性酶，因為突變體遺傳研究發(fā)現(xiàn)該基因與AtDGAT1不存在功能上的互補或冗余關(guān)系［41］。盡管如此，人們還是發(fā)現(xiàn)了一些產(chǎn)生富含獨特FAs的含油植物DGAT2，如蓖麻、油桐和鐵皮草，它們分別產(chǎn)生富含蓖麻油酸（12-OH 18：1 cisΔ9）、油麻酸（18：3 cisΔ9、transΔ11、transΔ13）和白醋酸（12-環(huán)氧、cisΔ9十八碳烯酸）的TAG［43］；此外，油棕EgDGAT2和椰子CoDGAT2具有對棕櫚酸（C16：1）和油酸（C18：1）的底物偏好，它們的過表達擬南芥種子中脂肪酸含量均發(fā)生了顯著差異變化［44-45］。這些研究結(jié)果均有力支撐了DGAT2在植物TAG生物合成中對獨特FAs的選擇偏好與TAG積累的積極貢獻。

花生AhDGAT1存在多個剪接變體，它們表現(xiàn)出不同的組織特異性表達模式，其中AhDGAT1.1過表達擬南芥種子的脂肪酸含量顯著提高［46］。AhGPAT2能夠在花生組織中廣泛表達，葉片和花中相對較高，酵母功能互補和煙草異源過表達結(jié)果均證明了該基因能夠改變或提高FAs含量，同時也改變了各種內(nèi)源脂代謝基因的轉(zhuǎn)錄水平［47］。人們在花生中還鑒定得到一個僅在未成熟種子（子葉）特異表達的AhDGAT3，該基因與DGAT1和DGAT2均不同源，屬于可溶性DGAT酶，能夠促進重組大腸桿菌中TAG的積累，并且優(yōu)先選擇18：1-CoA為酰基供體［48-49］。與其他已知植物相比，花生AhDGATs家族進化出了獨特的功能特性，對這些家族成員的遺傳多樣性、底物選擇性以及生理活性等進行深入研究，可能有助于篩選高油兼具優(yōu)異脂肪酸配比的油脂性狀。

3.4 磷脂：二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（PDAT）

不依賴Acyl-CoA的TAG合成是以DAG為酰基受體、磷脂為酰基供體進行的，該途徑利用磷脂：二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（phospholipid：diacylglycerol acyltransferase，PDAT）催化酰基從PC的sn-2位轉(zhuǎn)移到DAG的sn-3位生成TAG［50］。擬南芥中已鑒定出6個PDAT同系物，其中PDAT1在植物中占大部分PDAT活性。PDAT1可能不是擬南芥TAG合成和積累的直接貢獻因素，研究發(fā)現(xiàn)單一過表達或敲除AtPDAT1均沒有觀察到種子TAG和FA含量發(fā)生明顯變化［51-52］；另外，AtPDAT1可能與花粉發(fā)育相關(guān)，atdgat1-1/atpdat1-2基因型雙突變能導致不育花粉內(nèi)缺乏可見油體，種子含油量減少70%～80%，這就表明AtPDAT1和AtDGAT1對花粉活力和種子發(fā)育存在功能重疊，并且在TAG合成中PDAT途徑和DGAT途徑可能具有協(xié)同作用［41］。

不同植物的PDAT表達方式差異明顯，活性研究表明，該酶可能在多不飽和或獨特FAs的積累中發(fā)揮重要作用［50］。向日葵HaPDATs主要在種子發(fā)育后期表達，其中HaPDAT1c能夠恢復酵母突變體H1246細胞TAG的生物合成能力［53］。油菜BnPDAT1基因表達和種子TAG含量變化沒有明顯的直接關(guān)系，但高含油品系中的表達豐度顯著高于低含油品系［54］。花生全基因組生物信息學分析研究顯示，AhPDATs家族包含17個成員，系統(tǒng)進化上分為5個亞組，這些基因的組織時空表達模式差異明顯，并且存在豐富的可變剪接基因型［55］。目前已分離獲得AhPDAT1和AhPDAT2，熒光定量結(jié)果顯示AhPDAT1在花生種子中表達量最高，AhPDAT2在花生下胚軸中表達量最高，2個基因分別在果針入土后60 d和36 d的表達量遠高于其余各時期，此外基因表達受干旱、高鹽、低溫等9類非生物脅迫誘導，暗示了AhPDATs對花生油脂合成和抗逆的正面調(diào)控作用［56］。

4 展望

大量遺傳分析研究表明，花生油脂合成是受多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，單一改變某個基因的表達水平很難精準調(diào)控最終的油脂含量及其組分。隨著不同物種脂代謝的深入研究，人們對花生油脂合成中區(qū)室化途徑的相對貢獻以及關(guān)鍵限速酶基因的鑒定也有了積極的進展，但是主要集中在相關(guān)基因家族的克隆、表達和生物學功能初探，TAG合成網(wǎng)絡(luò)的多基因調(diào)控關(guān)系依然不明確。另外，單一的Kennedy途徑對花生TAG合成的貢獻率如何，PC在多大程度上參與了超長鏈飽和脂肪酸或其他未在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中修飾的脂肪酸的酰基轉(zhuǎn)移，以及TAG合成中每一步酯化反應(yīng)對酰基通量的需求等，這些問題的解決有助于更全面地了解花生油脂合成及其脂肪酸組成的機制。囿于技術(shù)限制和安全風險，目前通過基因工程手段來改良花生優(yōu)異性狀還無法大規(guī)模實現(xiàn)。盡管如此，隨著人們對花生油脂代謝不斷深入了解，對于今后花生油脂性狀的精準鑒定和創(chuàng)新利用具有重要意義。

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收稿日期：2022-12-20

基金項目：國家自然科學基金（編號：31701461）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（20）3121］；江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項目［編號：JBGS（2021）062］；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-13）。

作者簡介：沈 悅（1986—），女，江蘇宜興人，博士，助理研究員，主要從事花生遺傳育種與分子生物學研究。E-mail：syjaas@163.com。

通信作者：陳志德，博士，研究員，主要從事花生資源與遺傳育種研究。E-mail：chen701865@aliyun.com。