TRAIP基因沉默對TNBC細胞增殖和侵襲遷移影響

鄭艷 王萍 王笑 劉俐彤 陳召旭 王成勤

［摘要］ 目的 研究腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相互作用蛋白（TRAIP）在人三陰性乳癌（TNBC）中的表達及其對細胞增殖和侵襲遷移的影響。

方法 應(yīng)用免疫組化方法，檢測75例TNBC癌及癌旁組織中TRAIP的表達，并分析其與病人臨床病理特征的關(guān)系。采用Western blot技術(shù)檢測人TNBC細胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231及HCC1937中TRAIP的表達水平。構(gòu)建TRAIP慢病毒干擾載體并檢測干擾效率。應(yīng)用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（MTT）和Celigo細胞計數(shù)方法檢測細胞增殖能力，Transwell侵襲實驗和創(chuàng)面愈合法檢測細胞的侵襲遷移能力。

結(jié)果 TNBC組織中TRAIP的表達水平明顯高于癌旁組織（Z=－6.460，P<0.001）；與原發(fā)灶相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中TRAIP呈高表達（Z=－3.448，P<0.001），并且這種高表達水平與腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)（Z=－2.077，P<0.05）。Western blot檢測顯示，MDA-MB-231和HCC1937細胞株TRAIP蛋白表達均顯著高于MDA-MB-468細胞（F=34.96，P<0.01）；TRAIP基因敲除后，MDA-MB-231和HCC1937細胞中TRAIP的蛋白表達水平被明顯抑制（t=15.66、19.39；P<0.01）。相較于對照組，TRAIP基因敲除組細胞的增殖能力明顯減弱（F=71.63～218.07，P<0.01）；Transwell侵襲及創(chuàng)面愈合實驗表明，TRAIP基因敲除顯著抑制細胞的侵襲遷移能力（t=7.39～32.16，P<0.01）。

結(jié)論 TRAIP在TNBC組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達并與腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，敲除TRAIP基因可顯著抑制細胞的增殖、侵襲遷移等生物學(xué)特性。

［關(guān)鍵詞］ 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相互作用蛋白；三陰性乳腺癌；基因沉默；細胞增殖；腫瘤浸潤

［中圖分類號］ R737.9

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0021-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.012

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230303.1118.006.html;2023-03-06 10：52：13

EFFECTS OF SILENCING TRAIP GENE ON PROLIFERATION， INVASION， AND MIGRATION OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER CELLS

ZHENG Yan， WANG Ping， WANG Xiao， LIU Litong，? CHEN Zhaoxu， WANG Chengqin

（Department of Pathology，? School of Basic Medicine，? Qingdao University， Qingdao 266071，? China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To study the expression of tumor necrosis factor receptor-associated factor-interacting protein （TRAIP） in human triple-negative breast cancer （TNBC） and its role in cell proliferation， invasion， and migration.

Methods

We measured the expression of TRAIP in the cancer and paracancerous tissues from 75 cases of TNBC by immunohistochemistry， and analyzed its relationship with patients clinicopathological features. Western blot was used to determine the expression of TRAIP in human TNBC cell lines （MDA-MB-468， MDA-MB-231， and HCC1937）. We constructed a lentiviral vector targeting TRAIP， and measured its interference efficiency. Cell proliferation was determined using 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） and Celigo cell counting assays. Cell invasion and migration was measured by Transwell and wound healing assays.

Results ?The expression level of TRAIP was significantly higher in TNBC tissues than in paracancerous tissues （Z=-6.460，P<0.001）， and significantly higher in lymph node metastases than in primary foci （Z=-3.448，P<0.001）. A high TRAIP level was closely associated with tumor recurrence （Z=-2.077，P<0.05）. The protein levels of TRAIP in the MDA-MB-231 and HCC1937 cell lines were significantly higher than that in the MDA-MB-468 cell line （F=34.96，P<0.01）. After knocking out the TRAIP gene， the protein expression of TRAIP in the MDA-MB-231 and HCC1937 cell lines were significantly inhibited （t=15.66，19.39;P<0.01）. Compared with the control group， the TRAIP knockout group showed significantly decreased cell proliferation （F=71.63-218.07，P<0.01） and significantly reduced cell invasion and migration （t=7.39-32.16，P<0.01）.

Conclusion ?TRAIP is highly expressed in TNBC tissues and lymph node metastases， and is closely related to tumor recurrence. Silencing the TRAIP gene can significantly inhibit cell proliferation， invasion， and migration.

［KEY WORDS］ ?tumor necrosis factor receptor-associated factor interaction protein; triple negative breast neoplasms; gene silencing; cell proliferation; neoplasm invasiveness

乳癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的主要原因［1-2］。三陰性乳癌（TNBC）作為乳癌的一種亞型，是指人表皮生長因子受體2（HER2）、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）表達陰性的乳癌［3-4］。TNBC病人不能從內(nèi)分泌治療和HER2靶向治療中獲益，導(dǎo)致更高的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率［5-6］。因此，對TNBC新的治療靶點和靶向藥物的研究成為國內(nèi)外研究的熱點［7］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相互作用蛋白（TRAIP）是一種大小為53 000的E3泛素蛋白連接酶，包含3個結(jié)構(gòu)域，分別是N端附近的RING結(jié)構(gòu)域、假定的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coil）和亮氨酸拉鏈（leucine zipper）結(jié)構(gòu)域［8-9］。相關(guān)研究表明，TRAIP參與多種細胞過程，包括細胞增殖、DNA損傷應(yīng)答、有絲分裂和胚胎發(fā)育［10-14］。CHAPARD等［15］研究結(jié)果顯示，TRAIP位于有絲分裂染色體附近，通過紡錘體裝配檢查點調(diào)控有絲分裂過程。PARK 等［16］創(chuàng)建了TRAIP缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)由于早期胚胎發(fā)育遲緩，導(dǎo)致這些小鼠很快死亡。用慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默TRAIP，可強烈抑制人角質(zhì)形成細胞的增殖并導(dǎo)致細胞周期阻滯［17］。此外，TRAIP的失活將導(dǎo)致核苷酸嚴重破壞，從而危及基因組的穩(wěn)定性，表明TRAIP是哺乳動物復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分［18-19］。因此，TRAIP在生物學(xué)過程中發(fā)揮著極其重要的作用，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展奠定了細胞學(xué)基礎(chǔ)。然而，TRAIP基因在TNBC中的表達及潛在作用尚不清楚。本研究擬探討TRAIP在TNBC中的表達及其臨床意義，并探討TRAIP基因敲除對TNBC細胞增殖和侵襲遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院2013—2015年外科手術(shù)切除的75例女性新鮮原發(fā)性TNBC組織及其癌旁非瘤組織（距腫瘤邊緣＞2 cm），石蠟包埋切片均來自青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科。所有病人術(shù)前均未接受化療或放療并且臨床病理資料完整。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，相關(guān)臨床資料獲取均獲得所有病人書面同意。

1.2 實驗材料

所用人TNBC細胞MDA-MB-468、 MDA-MB-231和HCC1937購自中國科學(xué)院（中國上海）；胎牛血清購自美國 HyClone公司，DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；TRAIP抗體購自美國proteintech公司；β-actin抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；羊抗兔二抗購自上海翌圣生物科技股份有限公司；Sh-TRAIP病毒和Sh-NC病毒均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（MTT）購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海化學(xué)試劑有限公司；凋亡試劑盒購自上海賽默飛世爾科技有限公司；Caspase3/7試劑盒購自美國Promega公司；Transwell小室購自美國 Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD生物技術(shù)公司；結(jié)晶紫粉末購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色檢測組織中TRAIP的表達 將石蠟標本切片脫蠟、梯度乙醇水化，加入體積分數(shù)0.03的過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，以微波加熱進行抗原修復(fù)，再使用山羊血清封閉15 min，加入TRAIP一抗（1∶300稀釋，4 ℃，過夜）和二抗（1∶100稀釋，37 ℃，30 min）孵育。切片用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，蘇木精復(fù)染。以PBS為陰性對照。根據(jù)染色強度和腫瘤細胞陽性比例之和進行半定量評分。染色強度評分：0分，無著色；1分，著色較弱；2分，著色中等；3分，著色較強。陽性細胞比例評分：0分，無陽性細胞；1分，陽性細胞＜1/100；2分，1/100≤陽性細胞＜1/10；3分，1/10≤陽性細胞＜1/3；4分，1/3≤陽性細胞＜2/3；5分，陽性細胞≥2/3。以染色強度評分和陽性細胞比例評分相加作為總分，總分為0～8分［20］。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 將人TNBC細胞株MDA-MB-468、MDA-MB-231以及HCC1937置于含有體積分數(shù)0.10胎牛血清和10 g/L青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.3 慢病毒感染和細胞篩選 LV3-NC和LV3-hsa-TRAIP-318慢病毒載體由吉瑪公司構(gòu)建，取處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231和HCC1937細胞接種至6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞達到60%～70%融合時進行慢病毒轉(zhuǎn)染，

培養(yǎng)24～36 h后，用濃度為1 mg/L

的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。用于敲除TRAIP的目的序列為GGAGGAGAATGTC-TTGGATGC，對照組序列為TTCTCCGAACGT-GTCACGT。將轉(zhuǎn)染LV3-NC病毒的細胞作為Sh-NC組，將轉(zhuǎn)染LV3-hsa-TRAIP-318沉默病毒的細胞作為Sh-TRAIP組。

1.3.4 Western blot方法檢測細胞中TRAIP蛋白的表達 應(yīng)用RIPA裂解液在冰上充分裂解細胞，提取MDA-MB-231細胞和HCC1937細胞蛋白，取25 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，300 mA轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗TRAIP（1∶1 000）和β-actin（1∶4 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶4 000）室溫孵育2 h，重復(fù)TBST洗膜步驟，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光工作液室溫孵育1～2 min，暗室中顯影并用Image J軟件分析條帶灰度值。以灰度值表示蛋白表達量。

1.3.5 Celigo細胞計數(shù) 將感染慢病毒的MDA-MB-231和HCC1937細胞分別接種于96孔板，每孔2 000個細胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)體系為100 μL/孔。從第2天開始進行Celigo讀數(shù)，連續(xù)讀數(shù)5 d。

1.3.6 MTT實驗檢測細胞活性 將Sh-NC組和Sh-TRAIP組的細胞以每孔2 000個密度接種在96孔板上，每組重復(fù)6孔。細胞在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)1～5 d，每孔加入20 μL的MTT（5 g/L）溶液孵育2 h，棄去上清液，每孔中加入DMSO溶液150 μL，低速震蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm波長處光密度（OD）值。以O(shè)D值表示細胞活性。

1.3.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲及遷移能力 使用24孔板進行侵襲實驗，每孔7×104個細胞懸浮在無血清培養(yǎng)液中，并裝載到涂有基質(zhì)凝膠的腔室的上腔室，下腔室裝載含有高濃度的血清培養(yǎng)液，光鏡下觀察到有細胞穿過終止培養(yǎng)，室溫下甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色5 min。顯微鏡隨機計數(shù)5個視野內(nèi)入侵細胞數(shù)量。遷移實驗則是在小室上腔不涂基質(zhì)凝膠。

1.3.8 創(chuàng)面愈合實驗檢測細胞遷移能力 當6孔培養(yǎng)板的細胞密度達到90%左右時，用200 μL的黃色無菌槍頭制造創(chuàng)面。用PBS輕輕沖洗細胞以去除脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)液進一步培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、24 h后在顯微鏡下拍照計算創(chuàng)面相對寬度。

以上所有實驗均獨立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析；Celigo細胞計數(shù)和MTT實驗結(jié)果的比較采用兩因素析因設(shè)計的方差分析；TRAIP與臨床病理資料的關(guān)系分析采用Wilcoxon檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 TNBC組織及其癌旁組織TRAIP表達比較

免疫組織化學(xué)染色顯示，TRAIP陽性染色主要定位于細胞核和細胞質(zhì)，其在癌組織中的表達顯著高于相應(yīng)的癌旁組織（Z=－6.460，P<0.001）。與對應(yīng)的原發(fā)灶相比，TRAIP在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達水平較高（Z=－3.448，P<0.001）；TRAIP表達與病人的復(fù)發(fā)密切相關(guān)（Z=－2.077，P<0.05）。TRAIP的表達與病人年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級及血管侵犯無相關(guān)性（P>0.05）。見表1。

2.2 TNBC細胞系中TRAIP蛋白表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞和HCC1937細胞株的TRAIP蛋白表達水平均顯著高于MDA-MB-468細胞（F=34.96，P<0.01），而MDA-MB-231與HCC1937細胞株TRAIP蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。因此選擇MDA-MB-231和HCC1937來沉默TRAIP表達。Western blot檢測顯示，與對照組相比，MDA-MB-

231和HCC1937細胞中TRAIP的蛋白表達均被明顯抑制（t=15.66、19.39， P<0.01）。見圖1。

2.3 沉默TRAIP對TNBC細胞增殖能力的影響

Celigo細胞計數(shù)實驗結(jié)果顯示，沉默TRAIP對TNBC細胞系MDA-MB-231和HCC1937細胞株增殖能力影響的組別與時間之間存在交互效應(yīng)（F=71.63、218.07，P<0.01）；單獨效應(yīng)分析顯示，與Sh-NC組相比，Sh-TRAIP組MDA-MB-231和HCC1937細胞的數(shù)目明顯受到抑制（F=533.65、681.47，P<0.01）。MTT實驗結(jié)果表明，TRAIP敲降后對MDA-MB-231和HCC1937細胞增殖能力影響的組別與時間之間存在交互效應(yīng)（F=149.40、146.28，P<0.01）；單獨效應(yīng)分析顯示，Sh-TRAIP組MDA-MB-231和HCC1937細胞活力較Sh-NC組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=823.52、487.25，P<0.01）。見表2～5。

2.4 TRAIP沉默對腫瘤細胞侵襲與遷移的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞中Sh-NC組的細胞數(shù)量為839.74±69.54，Sh-TRAIP組為156.96±77.98；HCC1937細胞中Sh-NC組的細胞數(shù)量為1 183.96±184.41，Sh-TRAIP組為274.56±71.68，差異具有顯著性（t=32.16、24.61，P<0.01）。創(chuàng)面愈合實驗結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞中Sh-NC組的相對寬度為0.89±0.04，Sh-TRAIP組為0.48±0.03；HCC1937細胞中Sh-NC組的相對寬度為0.86±0.06，Sh-TRAIP組為

0.56±0.03，差異有顯著性（t=16.97、7.39，P<0.01）。

3 討? 論

根據(jù)美國癌癥協(xié)會2019年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，乳癌是

女性最常見的癌癥，是僅次于肺癌的第二大癌癥相關(guān)死亡原因［21］。基因表達譜分析顯示，大約有56%的TNBC和基底樣乳癌基因表達譜重疊，因此通常認為TNBC是基底樣乳癌的一種亞型［22］。與激素受體陽性或HER2陽性乳癌相比，TNBC病人的生存時間較短，診斷后5年內(nèi)病死率為40%［23］。不

同于其他類型乳癌主要轉(zhuǎn)移到骨骼和軟組織，TNBC最重要的特點是高度增殖以及頻繁地轉(zhuǎn)移到肺和腦［24］。總體來說，TNBC具有侵襲性更高、發(fā)病年齡更早、轉(zhuǎn)移潛能更大、臨床結(jié)局更差、復(fù)發(fā)率更高、生存率更低等特點［25］。靶向治療因具有特異性高、副作用小等獨有的優(yōu)越性已經(jīng)成為乳癌治療領(lǐng)域的研究熱點［26-27］。但是由于導(dǎo)致TNBC復(fù)發(fā)的分子機制尚未完全闡明，所以目前尚無明確的內(nèi)分泌及靶向治療方案。因此，研究TNBC的新治療靶點和靶向藥物已成為國內(nèi)外亟待解決的熱點問題。

泛素化被認為是一種保守的翻譯后蛋白修飾，主宰蛋白質(zhì)的命運，參與增殖、分化、凋亡或炎癥等多種生物學(xué)功能［28-29］。TRAIP是一種復(fù)制體相關(guān)的E3泛素蛋白連接酶［30］，研究發(fā)現(xiàn)TRAIP定位于DNA損傷位點，缺乏TRAIP的細胞會表現(xiàn)出典型的DNA損傷反應(yīng)缺陷表型［31］。GUO等［32］首次發(fā)現(xiàn)TRAIP在肝細胞癌病人中表達上調(diào)，并在肝癌細胞中表現(xiàn)出致癌性特征，與預(yù)后呈負相關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，TRAIP在TNBC組織中高表達，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達明顯高于原發(fā)灶；分析TRAIP在TNBC中的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TRAIP表達與腫瘤復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。因此推測TRAIP可能促進TNBC的增殖及侵襲遷移。

以往研究表明，TRAIP在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮了重要的作用。促進TRAIP的表達，會增強肺癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力［33］。HARLEY等［34］認為TRAIP是有效的細胞周期進展所必需的，TRAIP的突變限制了細胞增殖，可能是小頭癥和侏儒癥潛在的發(fā)病機制。在人表皮角質(zhì)形成細胞中，TRAIP可抑制細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞周期G1/S期阻滯［17］。TRAIP可通過多聚泛素化促進骨肉瘤細胞KANK1的降解，下調(diào)IGFBP3并激活A(yù)KT通路來調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞的增殖和侵襲［35］。本文研究MTT和Celigo細胞計數(shù)實驗結(jié)果表明，MDA-MB-231和HCC1937細胞中TRAIP基因敲除可以顯著抑制TNBC細胞的增殖能力；Transwell侵襲和創(chuàng)面愈合實驗表明，敲低TRAIP基因可顯著抑制細胞的侵襲和遷移。提示TRAIP可能與TNBC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是其分子機制尚待進一步探討。

綜上所述，TRAIP在TNBC組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中高表達，其高表達與腫瘤的復(fù)發(fā)等不良預(yù)后密切相關(guān)；敲低TRAIP能夠顯著抑制TNBC細胞的增殖、侵襲及遷移能力，其具體的作用機制有待進一步深入探究。TRAIP可能成為評估TNBC發(fā)生發(fā)展的重要生物標志物，也有可能成為治療TNBC的新型分子靶標。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）