有絲分裂激酶Aurora B對染色體形態(tài)變化的影響

王蕾 宋春林 張雨晴 張剛

［摘要］ 目的 探究有絲分裂激酶Aurora B對HeLa細(xì)胞染色體形態(tài)變化影響及其可能的作用機(jī)制。

方法

在HeLa細(xì)胞中加入二甲基乙酰胺（DMA），觀察染色體形態(tài)的變化；將HeLa細(xì)胞分為A、B組，分別加入DMSO和Aurora B激酶抑制劑處理，應(yīng)用Western blot檢測兩組組蛋白H3 S10的磷酸化水平，利用免疫熒光技術(shù)、活細(xì)胞成像和細(xì)胞染色體分離實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞的染色體形態(tài)變化；在B組細(xì)胞處理的基礎(chǔ)上加入磷酸酶抑制劑處理（C組），利用免疫熒光技術(shù)檢測磷酸酶對染色體形態(tài)變化的影響；使用小干擾RNA（siRNA）篩選Aurora B激酶的底物蛋白。

結(jié)果 A組和B組細(xì)胞中組蛋白H3 S10磷酸化水平比較差異有顯著性（t=23.58，P<0.05）。B組加入Aurora B激酶抑制劑處理30、60、90 min時染色體聚集細(xì)胞數(shù)量較A組顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=379.28～738.73，P<0.05），抑制Aurora B激酶能夠促進(jìn)染色體的聚集。A組、B組、C組染色體聚集的細(xì)胞數(shù)量差異有顯著性（F=969.20，P<0.05），其中C組明顯低于B組（t=22.41，P<0.05）。siRNA篩選結(jié)果顯示，染色體上可能存在多種Aurora B激酶的底物蛋白影響染色體的形態(tài)變化。

結(jié)論 有絲分裂激酶Aurora B通過磷酸化多種底物蛋白使染色體處于分散狀態(tài)，而磷酸酶則發(fā)揮去磷酸化作用促進(jìn)染色體的聚集，兩者協(xié)同調(diào)控有絲分裂染色體的形態(tài)變化。

［關(guān)鍵詞］ 極光激酶B；有絲分裂；染色體

［中圖分類號］ R345.57

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0016-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.010

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail//37.1517.R.20230220.1440.005.html;2023-02-21 14：23：42

EFFECT OF MITOTIC KINASE AURORA B ON MORPHOLOGICAL CHANGES OF CHROMOSOMES

WANG Lei， SONG Chunlin，? ZHANG Yuqing， ZHANG Gang

（Department of Biochemistry and Molecular Biology， School of Basic Medical Sciences， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ ?Objective ?To investigate the effect of mitotic kinase Aurora B on chromosome morphological changes in HeLa cells and its possible mechanism.

Methods ?Dimethylacetamide was added to HeLa cells to observe chromosomal morphological changes. HeLa cells were divided into groups A and B and were treated with DMSO and Aurora B inhibitor， respectively. We-

stern blot was used to measure the phosphorylation level of histone H3 S10， and immunofluorescence assay， live cell imaging， and cell chromosome segregation experiment were used to observe chromosome morphological changes. The cells treated with phosphatase inhibitor in addition to the treatment in group B were set up as group C， and immunofluorescence assay was used to observe the effect of phosphatase on chromosome morphological changes. Small interfering RNA （siRNA） was used to screen out the substrate proteins of Aurora B.

Results ?There was a significant difference in the phosphorylation level of histone H3 S10 between groups A and B （t=23.58，P<0.05）. Compared with group A， group B had a significant increase in the number of chromosome aggregation cells at 30，60， and 90 minutes of Aurora B inhibitor treatment （F=379.28-738.73，P<0.05）， indicating that inhibition of Aurora B promoted chromosome aggregation. There was a significant difference in the number of chromosome aggregation cells between groups A， B， and C （F=969.20，P<0.05）， and group C had a significantly lower number than group B （t=22.41，P<0.05）. The results of siRNA screening showed that there might be multiple Aurora B substrate proteins on chromosomes that in-

fluenced chromosome morphological changes.

Conclusion ?The mitotic kinase Aurora B makes the chromosomes in a dispersed state by phosphorylating multiple substrate proteins， while phosphatase exerts a dephosphorylation effect to promote the aggregation of chromosomes， thereby regulating the morphological changes of mitotic chromosomes in a synergistic way.

［KEY WORDS］ ?Aurora kinase B; mitosis; chromosomes

染色體的準(zhǔn)確分離能夠確保遺傳物質(zhì)平均分配到兩個子細(xì)胞中［1］。人源Aurora B基因定位于染色體17號染色體短臂13區(qū)［2］，其表達(dá)產(chǎn)物參與染色體乘客復(fù)合體（CPC）的形成和染色體的調(diào)控［3］。Aurora B激酶能夠?qū)θ旧w上多種蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化［4-5］并發(fā)生自磷酸化［6］，而PP2A-B56和PP1等蛋白磷酸酶可以通過對Aurora B激酶底物去磷酸化調(diào)控有絲分裂的正常進(jìn)行［7-9］。Hesperadin是一種Aurora B激酶抑制劑，可抑制其底物組蛋白H3 S10發(fā)生磷酸化［10］，而岡田軟海綿酸（OA）能夠抑制磷酸酶活性。最近的研究表明，染色體表面的多種蛋白質(zhì)被有絲分裂激酶磷酸化從而影響染色體的形態(tài)變化［11］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光技術(shù)、活細(xì)胞成像等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探究Aurora B激酶對有絲分裂染色體形態(tài)變化的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞資源中心。持續(xù)表達(dá)H2B-CFP的HeLa細(xì)胞系由課題組建立。DMEM培養(yǎng)液、L-15培養(yǎng)液（美國Gibco公司），胎牛血清（美國HyClone公司），Thymidine（美國Sigma公司），Hesperadin、DMA、OA（美國Selleck公司），鼠抗人Tubulin單克隆抗體、兔抗人H3 S10多克隆抗體（英國Abcam公司），鼠抗人Cyclin B1單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司），鼠抗人GAPDH單克隆抗體（美國Proteintech公司），DAPI、熒光二抗 Alexa Fluro Dyes 488（美國Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HeLa細(xì)胞置于添加體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和10 g/L青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot檢測組蛋白H3 S10的磷酸化水平 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以每孔約5×105個細(xì)胞的密度鋪在6孔板中，同時加入40 μL濃度為0.6 g/L的Thymidine進(jìn)行細(xì)胞同步化處理。18 h后將Thymidine用PBS洗掉，加入1 μL濃度為1 μg/L的DMA完全培養(yǎng)液過夜。將細(xì)胞分為A、B組，分別加入2 μL的二甲基亞砜（DMSO）和Hesperadin（濃度50 μg/L）處理1 h，收集細(xì)胞并用RIPA裂解液提取兩組細(xì)胞總蛋白。應(yīng)用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，加入10×蛋白上樣緩沖液100 ℃加熱10 min使蛋白變性。配制SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，加入50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗Cyclin B1（1∶200）、H3 S10（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）4 ℃搖床孵育過夜。然后使用TBST洗膜3次，加入相應(yīng)種屬二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，重復(fù)上述洗膜步驟3次；配制ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，檢測兩組細(xì)胞Aurora B激酶底物H3 S10的磷酸化水平。以GAPDH條帶結(jié)果為內(nèi)參照，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以H3 S10灰度值/GAPDH灰度值計算兩組細(xì)胞H3 S10蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測染色體的形態(tài)變化 6孔板中每孔分別放入1個爬片，按照1.2.2的方法處理和分組，每組設(shè)3個孔。分別在藥物處理30、60、90 min時棄掉培養(yǎng)液，PBS洗2次。每孔分別加入2 mL的40 g/L多聚甲醛，室溫固定細(xì)胞20 min。使用體積分?jǐn)?shù)0.005 Triton X-100/PBS給細(xì)胞膜打孔10 min，以PBST洗滌細(xì)胞2次，每次5 min。用鑷子將爬片取出放到濕盒中，加入體積分?jǐn)?shù)0.03 BSA/PBST室溫封閉1 h。吸掉封閉液，在爬片上滴加一抗Tubulin（1∶400），室溫孵育3 h或者4 ℃過夜。將爬片置于PBST中洗3次，每次5 min。使用DAPI（1∶1 000）和熒光二抗Alexa Fluro Dyes 488（1∶1 000）室溫染色1 h，重復(fù)上述洗片步驟。待爬片干燥后，滴加5 μL 封片劑封片。使用徠卡Thunder高分辨率顯微成像系統(tǒng)觀察圖像，計數(shù)兩組細(xì)胞中染色體環(huán)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 高分辨率活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)觀察染色體動態(tài)變化 將穩(wěn)定表達(dá)H2B-CFP的HeLa細(xì)胞系細(xì)胞接種在6孔板并進(jìn)行同步化處理，24 h后消化細(xì)胞并按照7∶1的比例鋪在含有新鮮培養(yǎng)液的活細(xì)胞培養(yǎng)皿中，12 h后加入DMA處理12 h。檢測前將兩組細(xì)胞培養(yǎng)液換為分別添加DMSO或Hesperadin的L-15培養(yǎng)液，將加入藥物前記為“0”時刻。使用40倍物鏡連續(xù)采集圖像30 min，間隔5 min記錄一次CFP信號，分析并提取所需要的靜態(tài)圖像。

1.2.5 細(xì)胞染色體分離實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞染色體聚集

將兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入DMSO或者Hesperadin處理1 h，將收集的有絲分裂細(xì)胞用PBS洗1遍并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞稀釋到109 / L，加入低滲緩沖液37 ℃處理10 min。在涂片機(jī)中放入載玻片和200 μL細(xì)胞懸液，1 300 r/min離心10 min。滴加40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，隨后加入體積分?jǐn)?shù)0.005 Triton X-100/PBS細(xì)胞打孔5 min。DAPI染色，顯微成像系統(tǒng)中使用100倍物鏡拍攝圖片，觀察抑制Aurora B激酶對染色體形態(tài)的影響。

1.2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測蛋白磷酸酶對染色體形態(tài)變化的影響 將同步化處理后的HeLa細(xì)胞分為A組、B組以及C組并加入DMA過夜處理。A組和B組細(xì)胞按1.2.2方法進(jìn)行處理，C組細(xì)胞同時加入Hesperadin和OA，90 min后固定細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，觀察抑制磷酸酶對染色體聚集細(xì)胞的影響。

1.2.7 siRNA篩選Aurora B激酶的底物蛋白 根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果選擇30個Aurora B激酶可能的相互作用蛋白［10］（大部分已被證明與染色體相關(guān)），由上海吉瑪基因公司合成針對不同蛋白的siRNA oligo。在HeLa細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Luciferase和不同的siRNA，加入Hesperadin處理1 h，固定細(xì)胞并使用DAPI和Tubulin抗體染色，熒光顯微鏡下計數(shù)染色體環(huán)狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0、Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)比較采用析因設(shè)計方差分析及單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 抑制Aurora B激酶活性對組蛋白H3 S10磷酸化水平影響

Western blot檢測顯示，A組、B組H3 S10蛋白磷酸化水平分別為1.14±0.06、0.22±0.04，兩組比較差異有顯著性（t=23.58，P<0.05）。見圖1。

2.2 抑制Aurora B激酶對有絲分裂染色體形態(tài)的影響

2.2.1 兩組染色體聚集細(xì)胞數(shù)量比較 免疫熒光染色顯示，A組細(xì)胞染色體排列分散，在未分離的中心體周圍呈玫瑰花環(huán)狀圓形結(jié)構(gòu)；B組有絲分裂細(xì)胞染色體聚集，堆疊在一起形成特異性環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖2A）。析因設(shè)計方差分析顯示，時間、組別及二者交互作用對染色體聚集細(xì)胞數(shù)量影響差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F組別=1 657.56，F(xiàn)時間=17.48，F(xiàn)時間×組別=14.94，P<0.05）。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，A組不同時間點(diǎn)染色體聚集細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.053，P>0.05），B組不同時間點(diǎn)染色體聚集細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.36，P<0.05）。與A組相比，B組在30、60和90 min時染色體聚集細(xì)胞數(shù)量顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=379.28～738.73，P<0.05）。組內(nèi)比較結(jié)果顯示，B組在60、90 min染色體聚集細(xì)胞數(shù)量較30 min明顯增多（P<0.05）（圖2B）。

2.2.2 兩組細(xì)胞染色體動態(tài)變化比較 A組細(xì)胞有絲分裂過程中染色體排列分散，圍繞中心體呈玫瑰花環(huán)狀圓形結(jié)構(gòu)；B組細(xì)胞加入Hesperadin后，染色體逐漸聚集，呈特異性環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.2.3 兩組細(xì)胞染色體分離情況比較 熒光顯微鏡下觀察顯示，A組細(xì)胞整體與放大圖片染色體排列較為分散；B組細(xì)胞染色體整體較為聚集，局部放大觀察發(fā)現(xiàn)，染色體之間出現(xiàn)黏連現(xiàn)象（圖4）。

2.3 抑制蛋白磷酸酶對染色體聚集的影響

免疫熒光檢測顯示，A組、B組和C組染色體聚

集細(xì)胞數(shù)量分別為（1.33±0.57）、（82.67±2.52）、（32.00±3.00）個，各組間比較差異有顯著性（n=100，F(xiàn)=969.2，P<0.05）。兩兩比較顯示，C組染色體聚集的細(xì)胞數(shù)量明顯低于B組（P<0.05），高于A組（P<0.05），說明抑制Aurora B激酶會導(dǎo)致磷酸酶發(fā)揮去磷酸化作用，促進(jìn)染色體的聚集。

2.4 Aurora B激酶底物蛋白篩選

免疫熒光結(jié)果顯示，MCM7組與Luciferase組染色體聚集細(xì)胞數(shù)量分別為77.33 ± 1.20、16.33 ± 0.88，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（t=40.92，P<0.05），表明MCM7蛋白被RNA干擾后，抑制Aurora B激酶導(dǎo)致染色體聚集細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖5）。

3 討? 論

細(xì)胞有絲分裂的正常進(jìn)行是保證染色體準(zhǔn)確分離的前提［12］。一系列的絲氨酸/蘇氨酸激酶在有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)可能會導(dǎo)致乳癌以及其他癌癥的發(fā)生和發(fā)展［13-14］。近年來的研究表明，Aurora B激酶過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并被認(rèn)為是一種潛在的生物標(biāo)志物［15］。由于Aurora B激酶調(diào)控有絲分裂的分子機(jī)制目前尚不完全清楚，因此，探討Aurora B激酶影響染色體分離的分子機(jī)制對于腫瘤的診斷、靶向治療具有重要意義。

本研究首次探究了Aurora B激酶對有絲分裂染色體形態(tài)變化的影響。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞有絲分裂期，抑制Aurora B激酶活性可引起組蛋白H3 S10磷酸化水平降低；免疫熒光實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞成像以及染色體分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制Aurora B激酶能夠促進(jìn)染色體的聚集。為進(jìn)一步探究Aurora B激酶調(diào)控染色體形態(tài)變化的分子機(jī)制，本研究在抑制Aurora B激酶的基礎(chǔ)上同時加入磷酸酶抑制劑觀察染色體形態(tài)變化，結(jié)果顯示抑制Aurora B激酶會導(dǎo)致磷酸酶發(fā)揮去磷酸化作用，促進(jìn)染色體的聚集；進(jìn)一步通過siRNA篩選發(fā)現(xiàn)，染色體上可能存在MCM7等多種Aurora B激酶的底物蛋白影響染色體的形態(tài)變化。

綜上所述，有絲分裂激酶Aurora B與蛋白磷酸酶協(xié)同調(diào)控有絲分裂染色體的形態(tài)變化。本課題下一步將通過免疫共沉淀等多種實(shí)驗(yàn)方法，鑒定本文篩選出的蛋白是否為有絲分裂激酶Aurora B的底物，并進(jìn)一步探究其作用位點(diǎn)和具體的分子機(jī)制，以了解染色體發(fā)生形態(tài)變化的生理意義，為腫瘤的臨床診斷和靶點(diǎn)治療提供理論基礎(chǔ)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）