大蒜NAC基因家族的鑒定與低溫表達分析

閆藝薇， 田潔，2*

（1.青海大學農林科學院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，西寧 810016； 2.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，西寧 810016）

大蒜（Allium sativumL.）是百合科蔥屬2年生草本植物，營養物質含量豐富，且含有多種生物活性成分，是世界范圍內種植面積較為廣泛的藥食兼用蔬菜。我國大蒜種質資源豐富，種植面積廣。聯合國糧食及農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）2017年的統計結果顯示，我國大蒜種植面積已有82萬hm2，占全球種植面積的52.0%；大蒜總產量為2 222萬t，占全球產量的78.9%[1]。目前，中國大蒜出口量及產量在全球遙遙領先[2]。大蒜作為青海省海東市樂都區的三大優勢品牌蔬菜之一，種植面積已達1 014 hm2[3]。樂都區的大蒜具有很強的藥用價值和保健作用[4]，但高原大蒜易受低溫脅迫，大蒜幼苗期持續低溫脅迫將嚴重影響其生長發育[5]。

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）家族是植物轉錄因子家族中最大的家族之一[6]。近年來，在長白落葉松[7]、剛毛檉柳[8]、水稻[9]、楊樹[10]和玉米[11]以及眾多園藝物種[12-14]中發現了大量NAC基因，研究表明，NAC轉錄因子家族積極參與植物對逆境脅迫的響應。趙艷青等[15]研究發現，黃瓜NAC基因家族在低溫處理下的表達發生顯著變化，說明其對響應低溫脅迫發揮重要作用。Hou等[13]發現，辣椒NAC基因家族中的CaNAC064能夠與低溫誘導蛋白互作，從而提高植株耐寒性。在百合科作物中，洋蔥[16]和卷丹百合[17]的NAC基因家族也具有低溫脅迫應答作用。但目前尚未見有關大蒜NAC基因家族的研究報道，因此，本研究以課題組前期對‘樂都紫皮大蒜’低溫脅迫轉錄組測序結果（未發表數據）為基礎，在NR、Swiss-Prot、Pfam 3個數據庫中進行注釋，基于注釋所得的NAC基因研究大蒜NAC轉錄因子家族對低溫脅迫的響應，以期為深入研究大蒜NAC轉錄因子家族的生物學信息和具體功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以‘樂都紫皮大蒜’的鱗莖為試驗材料，以草炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1的栽培基質進行種植，然后置于RDN-560E-4智能人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司）中，于光照強度200 μmol·m-2·s-1、光照時間14 h、晝溫25 ℃、夜溫15 ℃、空氣相對濕度70%的條件下進行培養。待培養至長出3～4片葉、株高10 cm左右時，對其進行如下處理：①對照（CK），繼續使用上述方法對大蒜幼苗進行培養，定期澆水以保持土壤濕潤；②低溫脅迫處理（CT），對大蒜幼苗進行晝夜均為4 ℃的培養，光照強度、光照時間及空氣相對濕度保持不變，定期澆水保持土壤濕潤。

在低溫處理0、4、12、24、120 h時進行取樣，3次重復。每個重復取長勢均勻的5株大蒜葉片做混樣處理。將取下的新鮮樣品立即放入液氮中冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 大蒜總RNA的提取、文庫構建及轉錄組測序

采用TRNzol Universal總RNA提取試劑盒提取植物總RNA，純化檢測合格后，進行真核生物mRNA的富集，隨后純化合成雙鏈cDNA進行PCR擴增；用AMPure XP beads 純化PCR產物，以得到最終的文庫。庫檢合格后，進行Illumina HiSeq 測序，通過Trinity拼接、Corset層次聚類后得到328 951條Unigene用于后續分析。

以‘樂都紫皮大蒜’低溫脅迫轉錄組測序結果（未發表數據）為基礎，在NR、Swiss-Prot、Pfam 3個數據庫中進行注釋，初步注釋到49個大蒜AsNAC基因。

1.3 大蒜NAC家族的鑒定及分析

通過DNAMAN軟件將所得的AsNAC核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，并利用在線網站ExPasy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）進行AsNAC蛋白理化性質分析，包括氨基酸長度、等電點、分子量、不穩定指數、脂溶系數以及總平均疏水指數。

1.4 系統進化樹的構建及同源性分析

采用MEGA 6軟件通過Muscle對大蒜和擬南芥（Arabidopsis thaliana）NAC的氨基酸序列進行多重比對，選擇極大似然法（maximum likelihood,ML）、設置自檢次數為1 000次進行系統進化樹的構建。利用在線工具iTOL（https://itol.embl.de/）對進化樹進行標記。

1.5 保守基序的測定及蛋白結構預測

利用在線網站MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）進行motif預測，數量設置為20，通過TBtools繪制結構域圖。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線工具進行AsNAC蛋白的二級結構模型預測。利用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）在線工具進行AsNAC蛋白的三級結構模型預測，并通過Pymol軟件對圖片進行美化。

1.6 實時熒光定量PCR分析

采用TRNzol法提取處理0、4、12、24、120 h的大蒜葉片總RNA，并通過Honor? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒合成cDNA。通過Primer Premier 5軟件設計熒光定量PCR引物（表1），以不同時期葉片的cDNA為模板、大蒜CYP基因為內參，將目的基因與內參基因進行擴增。每份樣品設置3次生物學重復，以大蒜CYP基因的表達量作為內參，采用2—ΔΔCT法計算各基因的相對表達量[18]。

表1 AsNAC 基因實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of AsNAC genes for real-time fluorescence quantification

2 結果與分析

2.1 大蒜NAC蛋白理化性質的分析

在NR、Swiss-Prot、Pfam 3個數據庫中進行注釋，初步注釋到49個大蒜AsNAC基因（表2）。對49個具有NAM和NAC功能結構域的大蒜NAC蛋白進行理化性質的分析發現，各NAC轉錄因子的理化性質差異較大。氨基酸長度以AsNAC011最小，為81 aa；以AsNAC031最大，為619 aa；平均為219.55 aa。等電點以AsNAC031最小，為4.78；以AsNAC006最大，為9.86；其中有16個NAC蛋白的等電點小于7，偏酸性；有32個NAC蛋白的等電點大于7，偏堿性；AsNAC035蛋白的等電點等于7，呈中性。蛋白分子量以AsNAC031最大，為70 229.04 Da；以AsNAC011最小，為9 293.66 Da；平均為25 800.09 Da。不穩定指數為16.76～51.78，脂溶系數為50.23～94.42。總平均疏水指數均小于0，說明49個NAC蛋白均為親水蛋白。

表2 大蒜NAC蛋白的理化性質Table 2 Physical and chemical properties of NAC proteins in Allium sativum L.

2.2 大蒜與擬南芥NAC家族的同源性分析

為研究大蒜與擬南芥NAC家族成員之間的進化關系，通過MEGA 6軟件構建大蒜與擬南芥NAC蛋白的進化樹，結果（圖1）表明，大蒜NAC蛋白共分為10個亞族（Ⅰ～Ⅲ，Ⅴ～Ⅸ，Ⅺ～Ⅻ）。其中，第Ⅸ亞族的NAC蛋白數量最多，內含7個AsNAC蛋白和11個ATNAC蛋白。第Ⅴ亞族僅有1個NAC蛋白（AsNAC049）。第Ⅳ亞族和第Ⅹ亞族僅有ATNAC蛋白，無AsNAC蛋白，說明大蒜在長期進化過程中可能丟失了部分NAC基因。有9個亞族同時具有大蒜和擬南芥的NAC蛋白，說明大蒜和擬南芥的NAC家族在進化水平上具有較高的相似性。

圖1 大蒜與擬南芥NAC轉錄因子系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of NAC transcription factors in Allium sativum L. and Arabidopsis thaliana

2.3 保守基序的測定

對大蒜49個NAC蛋白序列進行保守結構域分析，有48個AsNAC蛋白序列被鑒定出保守結構域，共得到20種motif。同時將這48個AsNAC蛋白序列通過極大似然法構建進化樹，共分為10個小組，如圖2所示，標注為a～j，其中j小組包含的AsNAC蛋白最多，有8個；e小組僅有AsNAC031蛋白。

圖2 大蒜NAC家族的蛋白保守基序Fig. 2 NAC proteins conservative motif of Allium sativum L.

分析motif和蛋白結構域（圖2）發現，AsNAC蛋白具有較為保守的N端和多樣的C端。其中motif 3、motif 4、motif 1、motif 2和motif 5為AsNAC轉錄因子N端的5個保守結構域，共18個蛋白同時含有這5個保守結構域，且相對位置也一致。同時這5個保守結構域出現的次數也最多，分別為38、39、48、48和27次。motif 6、motif 7、motif 8、motif 9、motif 10、motif 11、motif 12、motif 13、motif 14、motif 15和motif 18出現在一些AsNAC蛋白的C端。motif 16僅存在于g組中AsNAC029、AsNAC038、AsNAC015和AsNAC040蛋白序列的N端。motif 17僅出現在b組AsNAC蛋白（AsNAC018、AsNAC046、AsNAC047、AsNAC043、AsNAC017、AsNAC042）中，其中AsNAC047蛋白的N端和C端均有motif 17，其余5個AsNAC蛋白僅在N端存在motif 17。motif 19僅存在于i組AsNAC008和AsNAC026蛋白的N端。motif 20僅存在于i組AsNAC009和AsNAC026蛋白的C端。

2.4 大蒜NAC蛋白二級、三級結構預測

在同時含有motif 3、motif 4、motif 1、motif 2、motif 5的18個大蒜NAC蛋白中隨機篩選6個蛋白（AsNAC001、AsNAC010、AsNAC013、AsNAC014、AsNAC017、AsNAC047）對其進行二級和三級結構預測，結果（圖3和4）表明，無規則卷曲是構成大蒜NAC蛋白的重要組成部分，所占比例為48.18%～64.88%；其次是α-螺旋和延長鏈，占比分別為13.69%～32.73%和9.46%～20.33%（表3）。由此可見，大蒜NAC蛋白的三維模型具有高度的相似性，含有大量的無規則卷曲及延長鏈，與前期二級結構的各項預測結果一致。

圖3 大蒜NAC蛋白二級結構分析Fig. 3 Secondary structure prediction of NAC proteins in Allium sativum L.

圖4 大蒜NAC蛋白三級結構分析Fig. 4 Tertiary structure prediction of NAC proteins in Allium sativum L.

表3 大蒜NAC蛋白二級結構分析Table 3 Secondary structure prediction of NAC proteins in Allium sativum L.（%）

2.5 qPCR分析

為進一步探究大蒜NAC家族基因在低溫響應過程中起到的調控作用，對AsNAC001、AsNAC010、AsNAC013、AsNAC014、AsNAC017、AsNAC047共6個基因在葉片中的表達進行分析，結果（圖5）表明，隨著脅迫時間的延長，AsNAC001、AsNAC010、AsNAC013和AsNAC014基因的表達呈先升高再降低趨勢，且在低溫脅迫12和24 h時顯著上調表達；AsNAC017和AsNAC047基因的表達量在低溫脅迫初期（4 h）呈顯著下調表達，而后呈先升高后降低的趨勢。總體看來，AsNAC010基因的表達量最高，其次是AsNAC001和AsNAC014。由此可見，不同大蒜NAC基因可在不同脅迫時間發揮生理調控功能。

圖5 大蒜NAC基因在不同脅迫時間下的表達分析Fig. 5 Expression analysis of NAC genes in Allium sativum L. in different stress times

3 討論

大蒜的種植溫度雖然較為廣泛，但青藏高原常有的低溫氣候依然會影響大蒜幼苗的生長發育[19-20]。研究表明，低溫會造成細胞膜凍結，并通過生理機能及其他脅迫抑制植物的生長發育，對植物造成不可逆轉的傷害，從而嚴重影響其產量和品質[21-22]；極端溫度甚至會造成植物死亡[23]。

NAC家族作為植物轉錄因子家族中最大的家族之一[6]，主要存在于陸生植物中[24]。近年來已被證實在植物的生長發育過程中起到廣泛的調節作用，包括纖維發育[25]、葉片衰老[26]、細胞擴增[27]及果實成熟[28]等。此外，NAC對植物響應非生物脅迫也具有調控功能，約25%NAC基因參與一種或多種逆境響應[29]。目前，NAC基因在低溫脅迫應答中的作用受到越來越多研究者的關注，Mao等[30]研究發現，過表達TaNAC67的轉基因擬南芥在嚴重冰凍脅迫下的耐受能力強于野生型；王營等[31]分析細葉百合LPNAC13基因在低溫處理（2 ℃）下的表達特征，發現其根中LPNAC13基因在低溫脅迫6 h內表達顯著上調；宋琴等[16]研究表明，4 ℃處理使洋蔥幼苗葉片的NAC表達量顯著上調。本研究基于大蒜轉錄組測序結果進行分析，共獲得49個大蒜AsNAC基因，其數量低于擬南芥（117）、水稻（151）[32]、大豆（152）[33]等作物，可能是由大蒜基因組相對較保守。49個AsNAC蛋白均為親水蛋白，根據大蒜與擬南芥NAC家族的進化樹分析，將其分為10個亞族。同一亞族內的NAC蛋白序列相似度較高，可能具有相似的生理調控功能。其中，有9個亞族中同時包含大蒜和擬南芥的NAC蛋白，但不同亞族中的數量存在差異，可能是在長期的進化過程中存在基因復制或者基因丟失現象[34-35]；僅AsNAC049單獨為1個亞族，與擬南芥同源性較低，但其與第Ⅵ和第Ⅶ亞族有一定的相似度，推測其可能在大蒜的生長發育中具有特殊作用。大蒜NAC蛋白長度為81～619 aa，大部分AsNAC蛋白的N端都具有motif 3、motif 4、motif 1、motif 2、motif 5的結構域，且相對位置保持不變；而C端的motif差異較大，符合NAC蛋白N端保守、C端多樣化的特征[36]。但并不是所有NAC蛋白的N端都有上述5個保守結構域，AsNAC032、AsNAC028、AsNAC022、AsNAC023、AsNAC031、AsNAC045、AsNAC016、AsNAC041、AsNAC024蛋白的N端僅有motif 3、motif 4、motif 1、motif 2，無motif 5；AsNAC049蛋白的N端僅有motif 4、motif 1、motif 2、motif 5，無motif 3，說明AsNAC蛋白的N端在保守的同時也具有一定的多樣性。研究發現，NAC家族的部分保守結構域不僅對植物生長發育起調節作用，還對非生物脅迫的應答響應具有重要意義[37-39]。

對選取的6個大蒜NAC蛋白（AsNAC001、AsNAC010、AsNAC013、AsNAC014、AsNAC017、AsNAC047）進行二級和三級結構預測，結果表明三級建模與二級結構預測結果一致，且這6個蛋白結構高度相似，推測不同大蒜NAC蛋白可能具有相似的生理調控功能。進一步分析大蒜葉片中這6個NAC基因在低溫脅迫下的表達模式，有4個基因（AsNAC001、AsNAC010、AsNAC013、AsNAC014）在脅迫12和24 h時呈顯著上調表達；2個基因（AsNAC017、AsNAC047）在脅迫4 h時呈顯著下調表達，說明不同大蒜NAC基因可在不同脅迫時間發揮生理調控功能。Zhuo等[39]研究了15個梅花NAC基因的冷應激反應模式，發現PmNAC11、PmNAC20、PmNAC23、PmNAC40、PmNAC42、PmNAC48、PmNAC57、PmNAC60、PmNAC66、PmNAC86基因呈上調表達；PmNAC59、PmNAC61、PmNAC82、PmNAC85、PmNAC107基因呈下調表達。本研究中，AsNAC010的表達量最高，可能在大蒜應對低溫脅迫中起關鍵作用，但其具體調控機制仍需進一步研究。