健脾補腎法對人結(jié)直腸癌移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的影響

王夢涵 姚欣 袁婉婧 李梅 黃興瑜 孫怡 曾宏亮 謝彪

摘要：目的 探討健脾補腎法對人結(jié)直腸癌移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的影響。方法 于裸鼠右腿內(nèi)側(cè)接種人結(jié)腸癌細胞，建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，15d后脫頸處死剝離瘤體。對照組用生理鹽水灌胃，實驗組用健脾補腎中藥灌胃，免疫組化法檢測2組移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的表達。結(jié)果 免疫組化顯示，與對照組相比，實驗組的移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB的表達均明顯下調(diào)（P<0.05），微血管CD34及淋巴管D2-40也明顯下調(diào)（P<0.005）。結(jié)論 健脾補腎法能明顯下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織炎癥受體TLR4及RAGE、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、腫瘤新生血管標記物CD34及腫瘤新生淋巴管標記物D2-40的表達。

關(guān)鍵詞：健脾補腎法；結(jié)直腸癌；TLR4；RAGE；NF-κB；CD34；D2-40

中圖分類號：R735.3+7 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）03-0078-05

Effects of Spleen-and-Kidney Invigorating Method on TLR4， RAGE， NF-κB， CD34， D2-40 in Human Colorectal Cancer Transplanted Tumor Tissue

WANG Meng-han¹， YAO Xin¹， YUAN Wan-jing²， LI Mei²， HUANG Xing-yu²， SUN Yi¹， ZENG Hong-liang³， XIE Biao²

（1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410005， China; 3. Hunan Institute of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410031， China）

【Abstract】To study the effect of spleen-and-kidney invigorating method on TLR4， RAGE， NF-κB， CD34， D2-40 in human colorectal cancer transplanted tumor tissue. Methods： Human colorectal cancer cells were inoculated on the inside of the right leg of nude mice to establish a subcutaneous tumor transplantation model of human colorectal cancer in nude mice and the mice was sacrificed to remove the tumor from the neck 15 days later. The control group was given intragastric administration with normal salt and the experimental group was intragastrically given with decoction for invigorating spleen and kidney. The expressions of TLR4， RAGE， NF-κB， CD34 and D2-40 in the transplanted tumor tissues were detected by immunohistochemical method. Results： Compared with that of the control group， the expressions of TLR4， RAGE and NF-κB in the experimental group were significantly down-regulated（P<0.05）， and the expressions of CD34 in microvessels and D2-40 in lymphatic vessels were also significantly down-regulated（P<0.005）. Conclusion： The spleen-and-kidney invigorating method can significantly down-regulate the expression of inflammatory receptor TLR4 and RAGE， nuclear transcription factor NF-κB， tumor neovascularization marker CD34 and tumor neovascularization marker D2-40 in human colorectal cancer graft tissue.

【Key words】Spleen-And-Kidney Invigorating Method；Colorectal Cancer；TLR4；RAGE；NF-κB；CD34；D2-40

結(jié)直腸癌在我國癌癥病例中位于前5位，其發(fā)病率和死亡率也在逐年上升^［1-2］。結(jié)直腸癌目前治療以手術(shù)切除、放化療、靶向治療為主，但其復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率及病死率仍較高。相較于傳統(tǒng)手術(shù)治療，中醫(yī)藥對惡性腫瘤的治療也起到關(guān)鍵作用，具有多環(huán)節(jié)、多靶點的特點，是我國治療惡性腫瘤的特色療法^［3］。腎為先天之本，脾為后天之本，脾腎不足則氣血生化乏源，使臟腑功能失調(diào)，氣血津液運行不暢，痰濕瘀毒內(nèi)阻，日久則產(chǎn)生腫瘤。通過采取健脾補腎法治療結(jié)直腸癌能夠改善氣血津液的運行，提高機體的抵抗力，改善患者的生活質(zhì)量。

腫瘤的增殖與炎癥微環(huán)境、腫瘤新生血管及淋巴管有密切關(guān)系。TLR4的表達在啟動炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)腫瘤周圍的炎性環(huán)境起著關(guān)鍵作用^［4］。

研究發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）與炎性反應(yīng)、腫瘤侵襲力及血管再生均有關(guān)聯(lián)^［5］。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用^［6］。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中微血管CD34、微淋巴管D2-40表達明顯高于其在癌旁組織及正常組織^［7-8］，CD34、D2-40的表達上調(diào)可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有重要作用。本實驗以人結(jié)直腸癌移植瘤組織為研究對象，通過免疫組化法檢測2組移植瘤組織中炎性受體TLR4、RAGE，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及微血管CD34、微淋巴管D2-40的表達情況，探討健脾補腎法對人結(jié)直腸癌移植瘤組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF及裸鼠16只，雌雄各半，體重（18±2）g。購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004；動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0008）。自由飲水和進食，動物房恒溫24℃，相對濕度60%。

1.2 主要儀器 石蠟包埋機（YB-8LF）、輪轉(zhuǎn)式切片機（RM2245）、生物組織攤烤片機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司 YT-7F型）、自動組織脫水機（HP300）、顯微鏡（奧林巴斯 BX53）、細胞培養(yǎng)基（DMEM）。

1.3 藥品與試劑 健脾補腎類中藥顆粒購買于湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院（人參、黃芪、砂仁、白術(shù)、茯苓、陳皮、半夏、山藥、女貞子、墨旱蓮、菟絲子、枸杞、雞血藤、白花蛇舌草、三七、半枝蓮、甘草），每袋含13.8 g，用熱水調(diào)制成77 mL的中藥溶液（等效濃度）。NF-κB抗體、RAGE抗體、TLR4抗體、CD34抗體、D2-40抗體均購買于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。人結(jié)直腸癌細胞株（HCT116）購自中國科學院上海細胞庫。

1.4 分組、造模及給藥 16只裸鼠適應(yīng)約一周后進行腫瘤模型的建立。于右腿內(nèi)側(cè)皮下注射人結(jié)直腸癌細胞株（HCT116）0.15 mL（含細胞1×10⁷個）。造模后隨機分成對照組及實驗組，每組各8只。對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液0.4 mL·d^-1，實驗組灌胃健脾補腎類中藥23.4 g·kg^-1，2組均隔天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.5 取材 15d時脫頸處死裸鼠，剝離瘤體，眼科剪將其剪成兩塊，一塊常規(guī)石蠟包埋，一塊置于-80℃冰箱凍存待用。

1.6 免疫組化檢測腫瘤組織NF-κB、RAGE、TLR4、CD34、D2-40的表達 石蠟包埋組織切片、脫蠟處理、流水沖洗后用蒸餾水浸泡5 min；將切片置于pH值6.0的檸檬酸鈉緩沖液中煮沸15 min、流水沖洗；將切片浸泡于3%過氧化氫溶液20分鐘、PBS沖洗三次；封閉后分別加一抗NF-κB（1∶100）、RAGE（1∶100）、TLR4、CD34，4 ℃冰箱過夜，加二抗37℃烤箱內(nèi)孵育30 min、PBS沖洗三次；DAB顯色、蘇木素染液襯染；脫水、透明、封片。評判標準：由病理科醫(yī)師進行閱片。

NF-κB、TLR4顯示胞質(zhì)及胞膜陽性（有黃色或棕褐色顆粒）、RAGE顯示胞核及胞質(zhì)陽性（有黃色或黃棕色顆粒）。陽性細胞<5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別對應(yīng)0，1，2，3，4分。

微血管CD34及微淋巴管D2-40均在每張切片取5個400倍視野數(shù)血管及淋巴管總數(shù)，然后取其平均值。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用 均數(shù)±標準差（x±s）表示，2組間比較符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組裸鼠移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB免疫組化表達情況 結(jié)果顯示，TLR4、RAGE、NF-κB在對照組中呈現(xiàn)高表達，經(jīng)健脾補腎中藥干預后，與對照組相比，實驗組移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB的表達明顯下調(diào)，其差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1、表1。

2.2 2組裸鼠移植瘤組織微血管CD34、微淋巴管D2-40免疫組化表達情況 結(jié)果顯示，經(jīng)健脾補腎中藥干預后，與對照組相比，實驗組移植瘤組織中的血管CD34及淋巴管D2-40明顯減少，其差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.005），見圖2、表2。

3 討論

結(jié)直腸癌屬中醫(yī)學“腸溜”“腸澼”“積聚”等范疇。中醫(yī)學認為，本虛標實是結(jié)直腸癌的病機特點，本虛為脾腎虧虛，標實為濕熱毒邪積聚。健脾補腎法以益氣補腎健脾為主，兼以解毒消腫散結(jié)，從而達到“扶正不助邪，驅(qū)邪不傷正”的目的。現(xiàn)代藥理研究表明，人參具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性^［9］，茯苓具有抗炎和抗腫瘤的作用^［10］，黃芪、白花蛇舌草也具有抗癌作用^［11-12］，補腎類中藥可改善腎功能，延緩腎功能衰竭進展^［13］。

近年研究表明，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，而介導炎癥的TLR4、RAGE、NF-κB在許多癌細胞系和腫瘤組織都有表達，且與大部分癌癥的發(fā)展情況正相關(guān)^［14-15］。中醫(yī)藥在治療腫瘤疾病時也能下調(diào)TLR4、RAGE、NF-κB的表達^［16］。本次實驗發(fā)現(xiàn)健脾補腎法能夠下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB的表達，表明健脾補腎法能對抑制人結(jié)直腸癌移植瘤的增殖有效果。

健脾補腎法抑制腫瘤增殖可能通過減少腫瘤新生血管及淋巴管有關(guān)。CD34是一種在血管內(nèi)皮細胞、某些干細胞及祖細胞等表達的跨膜糖蛋白，是目前腫瘤新生小血管特異性相對較好的標記物^［17］。CD34陽性血管的微血管密度與結(jié)直腸癌的進展和預后有關(guān)^［18］。D2-40是腫瘤微淋巴管的特異標記物，對微淋巴管內(nèi)皮具有選擇性免疫反應(yīng)性，研究表明腫瘤組織微淋巴管內(nèi)皮細胞的D2-40的表達要高于癌旁組織^［19］。本次實驗發(fā)現(xiàn)健脾補腎法能下調(diào)人結(jié)直腸移植瘤組織中CD34、D2-40的表達，說明健脾補腎法能抑制人結(jié)直腸癌移植瘤的增殖。

健脾補腎法通過下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB的表達，同時下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織CD34、D2-40的表達，說明健脾補腎法能抑制腫瘤新生血管及淋巴管的形成，從而破壞腫瘤的生存環(huán)境，抑制腫瘤的增殖，并且可能通過TLR4/RAGE/NF-κB途徑，其具體作用機制仍需進一步研究。

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（收稿日期：2022-05-18）