煙草青枯病不同發病階段根際土壤酚酸物質與微生物的關系分析

范成平，白茂軍*，田玉琴，昝建朋，董延鑫，楊 索，王 瑩，陳 汶，楊小龍，李先偉，高正鋒，徐 絲

（1.貴州省煙草公司 安順市公司，貴州 安順 561000；2.云南農業大學 煙草學院，云南 昆明 650201）

烤煙是我國的重要經濟作物。近年來，頻繁發生的土傳病害造成了烤煙產量和質量的嚴重下降，嚴重威脅了我國烤煙的生產安全［1］。煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的細菌性土傳病害，在我國福建、四川、貴州等省份的植煙區暴發流行，每年造成的經濟損失在1000萬元以上［2］。目前，煙草青枯病的主要防治手段有生物防治［3-4］、化學防治［5-6］、農業防治等［7］，但防治效果均不理想，例如：生物防治存在防治效果緩慢、適用范圍有限、容易受環境影響等問題；化學防治存在容易造成環境污染、農藥殘留等問題；農業防治存在防治周期長、成本高等問題［8-9］。根際土壤微生物是土壤微生態系統最重要的組成部分，根系分泌物是根際土壤微生物的主要營養來源［10］，根系分泌物可以為微生物的生長提供碳源和氮源。酚酸類物質是根系分泌物中最主要的功能性物質，其對植物的自毒作用也是導致連作障礙的重要因素［11］。有研究表明，煙草根系分泌物中的某些低分子有機酸如肉桂酸、苯甲酸等能夠通過降低土壤pH值促進土壤真菌的生長和繁殖，起到調節土壤真菌群體結構的作用，并間接影響土壤的理化特性［12-13］。劉艷霞等［14］研究發現，煙草根系分泌物中的苯甲酸和3-苯丙酸能同時促進土壤中病原菌和拮抗菌的生長繁殖，但對病原菌的促進作用顯著強于拮抗菌，是造成長期連作煙草青枯病嚴重發生的重要誘因。另外，土壤養分失衡［15-16］也加劇了土傳病害暴發的概率［17］，造成植物生長不良、抗病性降低［18］。因此，土壤酚酸類物質和營養元素會直接影響植物病害的發生，也會通過改變土壤微生物群落的組成間接影響植物病害的發生和發展［19-20］。迄今有關根際土壤中酚酸類物質以及其他土壤因子對煙草青枯病發生的影響研究較少。鑒于此，筆者通過田間調查，收集青枯病不同發病程度的煙株根際土壤，測定土壤酚酸含量、理化性質指標以及細菌、真菌的群落結構，探究了根際土壤環境因子對煙草青枯病發生的影響，旨在為煙草青枯病的科學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

土壤取樣地位于貴州省安順市紫云縣大田壩村（106°18′19″E，25°34′40″N，海拔1044 m)。取樣區域為同一地塊，其土壤質地為砂質土，且肥力均勻、地塊平整。試驗地的基礎理化性質：pH值為5.21，有機質24.28 g/kg，全氮1.42 g/kg，堿解氮162.74 mg/kg，硝態氮19.18 mg/kg，銨態氮9.74 mg/kg，全磷0.03%，速效磷3.33 mg/kg，全鉀0.15%，速效鉀54.08 mg/kg。種植的煙草品種為云煙87。

1.2 樣品采集與制備

參照煙草病蟲害分級及調查方法［21］，將煙株按照發病程度進行劃分，即：健康煙株 （HTP），全株無病；中度發病煙株（MDQ），莖部病斑超過莖圍的1/2，或半數以上葉片出現輕度凋萎及少數葉片出現病斑；重度發病煙株（SDQ），莖部病斑環繞莖圍，或2/3以上葉片出現凋萎。

通過田間系統調查確定青枯病發病地塊后，在旺長期對不同青枯病發病程度的煙株根際土壤進行取樣，對相同發病程度的煙株取3株以上，采用抖根法收集根際0~2 mm的土壤，充分混勻后裝袋，一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于提取土壤DNA，另一部分貯存在4 ℃冰箱，用于測定土壤養分含量。

1.3 土壤理化性狀及酚酸類物質的測定

采用電位法測定土壤的pH值。土壤中堿解氮、硝態氮、銨態氮、速效磷、速效鉀和有機質含量的測定分別采用堿解擴散法、紫外分光光度法、可見分光光度法、0.05 mol/L HCl-0.025 mol/L（1/2H2SO4）法、NH4OAc浸提—火焰光度計測定法、重鉻酸鉀容量法—稀釋熱法。

土壤酚酸類化合物的測定采用高效液相(HPLC)法。首先對土壤進行前處理，稱取土樣20.0 g，置于50 mL離心管（3次重復），加入20 mL 1 mol/L NaOH后靜置24 h；然后在室溫下以200 r/min的轉速振蕩60 min，配平后離心20 min；然后用12 mol/L鹽酸將濾液酸化至pH值=2.5，2 h后離心除去胡敏酸，用1∶1的乙酸乙酯萃取3次；在50 ℃條件下旋轉蒸發，用純凈水溶解后，定容至2 mL，將其過0.22 μm的纖維膜，濾液用高效液相色譜測定。儀器為Aglient1200高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent (4.6 mm×250 mm)，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，采用全波長掃描法找到所測酚酸的最佳波長。流動相C（乙腈）和流動相D（0.3%磷酸水溶液）的梯度如下：0 min，流動相C 5%，流動相D 95%；3 min，流動相C 5%，流動相D 95%；14 min，流動相C 35%，流動相D 65%；18 min，流動相C 40%，流動相D 60%；20 min，流動相C 70%，流動相D 30%；20 min，流動相C 90%，流動相D 10%；25 min，流動相C 90%，流動相D 10%；25 min，流動相C 5%，流動相D 95%；30 min，流動相C 5%，流動相D 95%。標準樣品為鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、對香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸，進樣量為10 μL。

1.4 土壤微生物的測定

土壤細菌：采用Illumina Hiseq測序方法對土壤細菌的豐度和結構進行評價。采用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)對16S DNA 中V3～V4區域進行擴增，檢測細菌的群落結構與多樣性。使用TruSeq?DNA PCR-free Sample Preparation Kit試劑盒將純化的PCR產物進行文庫構建。經過Qubit和Q-PCR驗證文庫合格后，使用NovaSeq 6000對DNA文庫進行測序。通過Qiime V1.9.1去除測序數據中平均質量分數低(Q＜20)及長度短（＜100 bp）的低質量序列，得到最終的有效數據(Effective Tags)。利用Uparse對所有樣本的全部Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性序列聚類成為OTUs。進一步用Qiime V1.9.1中的BLAST方法與Unit (v7.2)數據庫對OTUs序列進行物種注釋，獲得不同分類水平下微生物的豐度數據。

土壤真菌：使用MN NucleoSpin soil Kit (Machery-nagel，Dueren，Germany)從0.75 g土壤中提取總DNA。根據真菌的ITS1保守區使用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）進行擴增。擴增體系為50 μL：10×Buffer KOD 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、Index Primer（10 μmol/L)1 μL、Universal PCR Primer（10 μmol/L)1 μL、KOD酶1 μL、Template（100 ng/μL)1 μL，用ddH2O補至50 μL。對每個樣品進行重復擴增、合并，然后使用Cycle Pure Kit(Omega，Norcross，GA，USA)進行純化，形成測序文庫，最后使用Illumina HiSeq 2500技術進行測序分析。

1.5 數據處理

利用SPSS 22.0和Excel 2010軟件對試驗數據進行處理；用LSD法進行差異顯著性檢驗；利用R語言進行插圖繪制。

2 結果與分析

2.1 青枯病不同發病階段煙株根際土壤理化性狀差異分析

從表1可以看出，青枯病不同發病階段煙株的土壤理化性狀與健康煙株存在顯著差異。具體來說，青枯病不同發病階段煙株根際土壤的堿解氮、硝態氮和速效鉀含量均高于健康煙株根際土壤的，其中土壤堿解氮和硝態氮含量隨發病程度的加重而增加，且差異達到了顯著水平；土壤pH值和銨態氮含量在HTP和SDQ兩個處理間差異顯著，SDQ較HTP分別降低了8.38%和26.95%。

表1 健康煙株與不同患病程度煙株根際土壤的理化性狀

選擇差異顯著的3個理化指標（有機質、堿解氮、硝態氮含量），結合OTUs數據矩陣進行冗余分析（RDA）。

2.2 青枯病不同發病階段煙株根際土壤酚酸類物質差異分析

表2顯示：鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、香草酸、水楊酸這4種酚酸含量在健康和發病煙株根際土壤樣品間沒有顯著差異；香蘭素、對香豆酸、阿魏酸、苯甲酸這4種酚酸含量在健康土壤樣品(HTP)和中度發病土壤樣品(MDQ)間均沒有顯著差異，而在HTP和重度發病土壤樣品(SDQ)之間均存在顯著差異，其中香蘭素含量表現為SDQ＞HTP，而對香豆酸、阿魏酸、苯甲酸含量均表現為SDQ＜HTP。

表2 健康與患病煙株根際土壤的酚酸類物質含量 μg/g

選擇含量差異顯著的香蘭素、對香豆酸、阿魏酸、苯甲酸這4種酚酸類物質，結合OTUs 數據矩陣進行冗余分析（RDA）。

2.3 健康與發病煙株根際土壤微生物群落多樣性分析

2.3.1 根際土壤細菌和真菌的Alpha多樣性 Ace指數和Chao1指數可以反映群落的物種豐富度，Shannon指數和Simpson指數可以綜合反映群落的物種豐富度和均勻度。本研究結果（表3）表明，在不同土壤樣品間細菌和真菌的上述4個多樣性指數均無顯著差異，但健康煙株根際土壤細菌的Shannon、Chao1、Ace指數均高于發病煙株根際土壤的；健康與發病煙株根際土壤真菌的Shannon指數與Simpson指數相近，Ace、Chao1指數隨發病程度加重有先下降后增加的變化趨勢。

表3 煙株根際土壤微生物群落的Alpha多樣性指數分析結果

2.3.2 健康與發病煙株根際土壤細菌和真菌的Beta多樣性 健康與發病煙株根際土壤細菌和真菌的NMDS圖如圖1所示，細菌（圖1A）和真菌（圖1B）的stress值分別為0.002、0.011，均小于0.1，說明此模型能較準確地描述不同土壤樣本間微生物群落結構的差異。中度發病（MDQ）與健康煙株（HTP）根際土壤樣品間細菌群落結構的差異小于重度發病（SDQ）與HTP煙株根際土壤樣品間的（圖1A），而在HTP、MDQ和SDQ煙株根際土壤樣品間真菌群落結構有較大的差異（圖1B），說明組間樣本的Beta多樣性隨發病程度增加而差異逐漸增大。

圖1 健康與發病對煙株根際土壤微生物群落Beta多樣性的影響

2.3.3 健康與發病煙株根際土壤微生物在門水平上的差異 對不同土壤樣品的測序結果進行分析，在不同青枯病發病程度煙株根際土壤細菌中所占比例較高的門有變形菌門(Proteobacteria)、Patescibacteria、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等。比較不同發病程度煙株根際土壤細菌門類的差異，變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)等在發病土壤中的相對豐度高于健康土壤的，厚壁菌門、酸桿菌門(Acidobacteria)等在健康土壤中的相對豐度高于發病土壤的。隨著發病程度的增加，Patescibacteria的相對豐度從11.63%增加至16.96%，厚壁菌門從13.27%降低至8.84%（圖2A）。不同發病程度煙株根際土壤真菌的優勢類群為子囊菌門(Ascomycota)、Anthophyta、毛霉門(Mucoromycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)，其中，子囊菌門的相對豐度表現為發病土壤＞健康土壤，而Anthophyta的相對豐度則表現為健康土壤＞發病土壤（圖2B）。

圖2 在門水平上不同發病程度煙株根際土壤微生物的物種分布

2.3.4 健康與發病煙株根際土壤微生物在屬水平上的差異 按照物種豐度排名，篩選出前10名屬水平的菌群。在健康土壤樣品（HTP）的細菌中，芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和Bdellovibrio的相對豐度較高；與HTP土壤樣品相比，SDQ中上述幾個屬的相對豐度均有所降低（圖3A）。與HTP樣品相比，在MDQ的真菌中，被孢霉屬（Mortierella）、毛霉屬（Mucor）和Pseudaleuria的相對豐度均有所增加，而在SDQ中有所下降；Gongronella的相對豐度在MDQ中下降，而在SDQ中增加（圖3B）。

圖3 在屬水平上不同發病程度煙株根際土壤微生物的物種分布

2.3.5 微生物群落組成與土壤環境因子的相關性 從圖4A可以看出：2個排序軸解釋了95.88%的土壤細菌菌群變化，其中CCA1解釋了84.49%，CCA2解釋了11.39%；健康煙株和中度發病煙株根際土壤樣品主要分布在第三象限，重度發病煙株根際土壤樣品主要分布在第二象限；土壤硝態氮(NO-N)和堿解氮(AN)含量與橫坐標正軸的夾角小于其他指標的，表明這2個指標與CCA1的相關性較強；土壤苯甲酸和對香豆酸含量與縱坐標重合，表明這2個指標與CCA2的相關性很強；從箭頭分布來看，土壤香蘭素、硝態氮和堿解氮含量與重度發病煙株根際土壤細菌菌群存在較強的正相關性。由圖4B中的箭頭長度可以看出：土壤苯甲酸和對香豆酸含量對根際土壤真菌菌群結構的影響較大；Bdellovibrio和鞘氨醇單胞菌屬與土壤阿魏酸、對香豆酸、苯甲酸含量呈正相關，與有機質(SOM)、NO-N和AN含量呈負相關；毛霉屬和Pseudaleuria與土壤阿魏酸、對香豆酸、苯甲酸含量呈正相關，與NO-N和AN含量呈負相關。

圖4 土壤因子與微生物群落間CCA分析結果

3 討論

良好的土壤環境可以為農作物的健康生長奠定基礎，而土壤養分失衡、板結等是引發煙草青枯病的主要原因［22］。本研究發現，不同程度青枯病發病煙株根際土壤的堿解氮（AN）、硝態氮（NO-N）和速效鉀（AK）含量均高于健康煙株根際土壤的，可能是因為不同發病階段的根際土壤養分失衡，而部分養分富集會增加煙株的感病性［23］。有研究表明，施用不同形態的氮既可以為植物提供養分，又具有減輕烤煙青枯病發生的作用，其中硝酸鹽的同化有助于青枯菌在根系的黏附、莖部的定殖以及毒性增強［24］。在本試驗中，土壤硝態氮和堿解氮的含量與重度發病煙株根際土壤細菌菌群存在較強的正相關性，可能是因為發病煙株根際土壤含有較多的硝態氮，而硝酸鹽同化的增加導致發病程度加重。

作物根際土壤微生物會隨著發病程度的變化而變化。黎妍妍等［25］的研究結果表明，青枯病發病煙株根際土壤細菌的多樣性低于健康煙株根際土壤的，而土壤真菌的多樣性會隨著發病程度的加重而逐漸增加，這與本研究結果相似。在本研究中，中度發病土壤中真菌被孢霉屬(Mortierella)、毛霉屬(Mucor)和Pseudaleuria的相對豐度高于健康土壤的，這可能是因為Pseudaleuria屬于子囊菌門(Ascomycota)中的小囊菌目(Microascales)，而小囊菌目中的真菌能夠引發多種植物病害［26］。本研究還發現，土壤細菌群落中鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和Bdellovibrio的相對豐度隨著發病程度的增加而逐漸下降，這是因為鞘氨醇單胞菌屬是土壤中的有益微生物［27］，它的減少可能導致病原微生物數量的增加。因此，推測煙株根際土壤中毛霉屬與Pseudaleuria豐度的增加以及鞘氨醇單胞菌屬豐度的降低可能是青枯病發生程度加重的關鍵微生物因素。

土傳病害、根系分泌物及根茬殘留腐解物的化感自毒作用被認為是引起作物連作障礙的主要因子，且根系分泌物是連作制度下土傳病害發生的原初誘因［28］。根系分泌物對某些微生物具有吸引作用，這類具有趨化性的細菌或真菌能夠在根際土壤中大量聚集和繁殖，比如豆科植物對根瘤菌的誘導；而根系分泌物對某些病原菌具有抑制作用，比如小麥根系分泌物中的酚酸具有抗細菌的活性，并且其抗菌活性具有協同作用［14］。本研究結果表明：土壤香蘭素含量與重度發病煙株根際土壤細菌與真菌菌群均存在較強的正相關性；真菌中的毛霉屬和Pseudaleuria，以及細菌中的Bdellovibrio和鞘氨醇單胞菌屬與土壤阿魏酸、對香豆酸、苯甲酸含量均呈正相關。張克勤等［29］研究表明，阿魏酸和苯甲酸在根際土壤中存在強烈的自毒效應，其中阿魏酸是煙草根系分泌物中的主要酚酸，其分泌速率分別是對羥基苯甲酸和苯甲酸的12.2和38.5倍。通過適當提高土壤pH值來增加土壤自毒酚酸物質的分解速率，該方法能有效地防治煙草青枯病［30］。苯甲酸等能夠通過降低土壤的pH值促進真菌的生長和繁殖，起到調節土壤真菌群體結構的作用，并間接影響土壤的理化特性［12］。但土壤微生物群落是一個復雜的群體，其微生物種類、數量以及相互作用關系受多方面因素的調節，單從根系分泌物上不能完整解釋其動態變化的過程，尚需要結合土壤養分、水分及微生物間互作關系開展進一步研究。

4 結論

煙株根際土壤酚酸類物質在患病與健康土壤中存在顯著差異，患病煙株根際土壤細菌的多樣性降低，真菌的多樣性隨青枯病發生程度的加重而先降低后增加，其中毛霉屬和Pseudaleuria的相對豐度在中度發病土壤中增加，鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度在患病土壤中降低，均與土壤對香豆酸、阿魏酸、苯甲酸含量呈正相關。