不同種植地天麻6種主要成分的比較研究

楊成翠，唐玉鳳，程立君，馬克堅，高國希，李春燕，楊順強*

（1.昭通學院 農學與生命科學學院/云南省天麻與真菌共生生物學重點實驗室/云南省天麻綠色種植與加工工程研究中心，云南 昭通 657000；2.云南省中醫中藥研究院，云南 昆明 650000；3.西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100；4. 云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650000）

天麻是我國傳統貴重藥材，一般認為天麻素是天麻重要的活性成分，2010 版《中國藥典》中天麻質量標準也是以天麻素作為重要的參考指標［1］。隨著研究的深入，學者們普遍認為天麻藥效作用的發揮主要是其多個成分協同作用的結果，其中天麻素、對羥基苯甲醇（天麻苷元）、對羥基苯甲醛等酚類化合物被認為是天麻的主要活性成分。2020年版《中國藥典》中要求天麻供試品色譜中應呈現6個特征峰，樣品中天麻素和對羥基苯甲醇的總含量不低于0.25%，另外4個特征峰為巴利森苷類物質的特征峰［2］。隨著研究的深入，巴利森苷類物質逐漸被認為是天麻的重要有效成分。劉智慧等［3］研究表明，巴利森苷A和巴利森苷C可顯著改善東莨菪堿損傷的空間學習記憶能力，且改善效果優于天麻素；Wang等［4］研究認為，巴利森苷J和巴利森苷B對心肌細胞有顯著的保護作用；Wang等［5］研究認為，巴利森苷及其衍生物對6-羥基多巴胺誘導的細胞死亡具有一定的保護作用［5］；康傳志等［6］研究表明，天麻素類與巴利森苷類物質在生物合成和積累上存在必然的聯系，各成分間在植物機體內必然存在相互轉化。天麻生長發育和主要成分的積累受產地條件［7-8］、栽培模式［9-10］、種苗等級［10-11］、天麻種質［5,12-13］等因素的綜合影響。但是相同來源的天麻種苗，采用相同的栽培模式在不同環境條件下栽培，其藥用活性成分也可能會存在個體和產地間的差異，為此，本研究對不同種植地天麻個體中天麻素、天麻苷元和巴利森苷A、B、C、E 含量進行了比較研究，以期為天麻資源開發利用、品種選育和科學栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年1月，將來源于昭通市小草壩鎮小草壩村同一種植戶，單個重20~30 g的天麻種（烏天麻）分別栽種于云南省昭通市彝良縣小草壩鎮小草壩村(以下簡稱小草壩鎮，編號XCB)、云南省昭通市鎮雄縣碗廠鎮白巖壩村(以下簡稱碗廠鎮，編號WC)、云南省昭通市永善縣水竹鄉水竹村(以下簡稱水竹鄉，編號SZ)及貴州省畢節市國家森林公園拱攏坪雷音谷景區(以下簡稱拱攏坪雷音谷景區，編號GLP)4個不同的種植地。2019年1月20日，分別從上述栽培點采樣，采集3個生長健壯，無病蟲害，單個重100 g左右的天麻作為樣品，用清水洗凈，100 ℃蒸制透心，冷卻，65 ℃烘干，粉碎過3號篩，備用。3個天麻的混合樣為1次重復，重復3次。

1.2 儀器與試劑

LC-30AD高效液相色譜系統包括高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、UV-VIS檢測器和色譜工作站（日本島津公司）。

標準品天麻素（批號110807-201809）和對羥基苯甲醇（批號111970-201702）均購于中國食品藥品檢定研究院；標準品巴利森苷A（批號PS011129）、巴利森苷B（批號PS011138）、巴利森苷C（批號PS011140）、巴利森苷E（批號PS012053）均購于成都普思生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準品溶液制備 精密稱取適量天麻素、對羥基苯甲醇和巴利森苷A、B、C、E對照品，加75%乙醇溶解，分別制成單個對照品儲備液，再分別精密量取各對照品儲備液適量，制成混合對照品溶液，置于4 ℃備用。

1.3.2 樣品液制備 稱取1.0 g左右天麻樣品，置于錐形瓶中，加入75%乙醇25 mL，超聲提取30min，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，濾液用于天麻素、對羥基苯甲醇及巴利森苷類物質的測定，每個天麻3次重復。

1.3.3 測定方法 采用高效液相色譜法對天麻素、對羥基苯甲醇和巴利森苷含量進行測定。色譜條件：色譜柱為Phernomex Gemini 5 μ C18 110A（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流動相為乙腈(A)、0.1%磷酸水(B)。0~10 min，A∶B=2∶98；10~20 min，A∶B=8∶92；20~30 min，A∶B=12∶88；30~47 min，A∶B=25∶75；47~53 min，A∶B=90∶10；53~60 min，A∶B=2∶98。流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：5 μL。

1.4 數據處理

試驗數據采用 Microsoft Excel 2016 軟件進行處理，采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行方差分析和多重比較（新復極差法）。

2 結果與分析

2.1 標準品和樣品成分分離測定

將混合標準液和天麻樣品提取液上機檢測，在50 min內，標準液檢測出了天麻素(GA)、對羥基苯甲醇(HA)和巴利森苷A(PA)、巴利森苷B(PB)、巴利森苷C(PC)、巴利森苷E(PE)6種天麻的主要成分，獲得了基線穩定、無拖尾、靈敏度高的理想圖譜。天麻樣品液也檢測出了多種天麻的主要成分（圖1）。根據混合標準溶液的圖譜，以質量濃度對峰面積制作標準曲線，得出各成分濃度與峰面積的線性回歸方程，線性關系良好（表1），可作為樣品中各成分含量計算使用。

表1 天麻6種主要成分的回歸方程及相關系數

圖1 混合對照品溶液和天麻樣品的HPLC色譜圖

2.2 天麻樣品重量及含水量

由表2可以看出，不同種植地天麻樣品平均鮮重差異不顯著，其中SZ種植地天麻樣品的平均鮮重最重，為104.737 g/個；XCB、SZ和WC這3個種植地天麻樣品的平均干重差異不顯著，WC種植地天麻樣品的平均干重最重，為26.818 g/個，顯著高于GLP種植地的；GLP種植地天麻樣品的平均含水量最高，為80.18%，顯著高于SZ和WC這2個種植地的，WC種植地天麻樣品的含水量最低，為74.10%，上述分析表明種植地不同影響了天麻的含水量。

表2 不同種植地天麻樣品含水量和重量

2.3 同一種植地天麻樣本間主要成分的含量

同一種植地天麻樣本間GA、HA、PA、PB、PC、PE含量及巴利森苷總量差異明顯（表3）。XCB種植地天麻樣本間的GA含量差異極顯著，其中XCB-1樣本中的GA含量最高，為2.186 mg/g；XCB-2樣本中的HA、PA、PB和PC含量均最高，分別為0.750、6.596、2.895和1.358 mg/g，均極顯著高于XCB-1和XCB-3的；XCB-3樣本中的PE含量極顯著高于XCB-1和XCB-2的，為9.693 mg/g。SZ種植地的天麻樣本間，SZ-2中的GA、HA、PA、PB和PC含量均極顯著高于SZ-1和SZ-3的，分別為：2.313、1.167、14.377、4.665和2.586 mg/g；SZ-3中的PE含量極顯著高于SZ-1和SZ-2的，為8.999 mg/g。WC種植地的天麻樣本間，WC-1和WC-2中的PC含量分別為1.695、1.684 mg/g，極顯著高于WC-3的，而在WC-1和 WC-2間差異不顯著；WC-1中的PE含量為13.074 mg/g，極顯著高于WC-2和 WC-3的；WC-2中的GA、HA、PA和PB含量均最高，分別為0.207、3.534、12.953和3.964 mg/g。GLP種植地的天麻樣本間，GLP-1樣本中的GA、PC和PE含量均極顯著高于GLP-2和GLP-3的，分別為3.849、2.310和4.260 mg/g；GLP-2中的PA含量最高，為6.753 mg/g，極顯著高于GLP-1和GLP-3的；GLP-3中的HA和PB含量均極顯著高于GLP-1和GLP-2的，分別為1.047和3.946 mg/g。各種植地天麻樣本間巴利森苷總量差異均達極顯著水平，其中SZ-2樣本的高達27.847 mg/g，GLP-2的僅為11.540 mg/g。

表3 不同產地天麻中主要成分含量 mg/g

2.4 不同種植地天麻主要有效成分的含量

由表3可知，不同種植地天麻樣本間GA的平均含量差異明顯，其中GLP種植地的平均含量最高，WC種植地的平均含量最低，分別為3.378和0.198 mg/g；WC種植地的HA平均含量為2.340 mg/g，顯著高于其他3個種植地的，XCB、SZ和GLP這3個種植地樣本間的HA平均含量差異不顯著。各種植地間PA、PB、PC和PE的平均含量差異均不顯著，其中，SZ種植地的PA、PC平均含量均最高，分別為10.179和1.904 mg/g，XCB種植地的均最低，分別為4.623、0.968 mg/g。WC種植地的PE平均含量最高，為7.952 mg/g，GLP種植地的最低，僅為3.411 mg/g。巴利森苷總量平均值從高到低依次為SZ（22.371 mg/g）＞WC（19.869 mg/g）＞XCB（15.388 mg/g）＞GLP（13.011 mg/g）。不同種植地天麻中GA、HA、PA、PB、PC、PE的平均含量及巴利森苷總量的平均值差異較大，但大多差異不顯著。

3 討論與結論

康傳志等［14-17］研究表明，巴利森苷是天麻素和檸檬酸縮合而成的酯類物質，天麻素和巴利森苷等主要成分在天麻體內存在相互轉化。本試驗中，不同種植地間GA和HA含量差異明顯；PA、PB、PC、PE含量和巴利森苷總量差異較大，但均未達顯著水平，表明天麻中主要有效成分含量因種植地環境不同而存在差異。這可能是因為不同種植地生態環境條件的不同而影響了天麻主要成分的轉化和積累，可為天麻高品質定向科學栽培提供依據。

鄭治洪等［18-21］對不同規格等級的天麻主要成分做了大量研究，發現天麻主要成分含量因天麻規格等級不同而存在差異。本試驗中，同一種植地相似規格的各天麻樣本間GA、HA、PA、PB、PC、PE含量和巴利森苷總量差異明顯。表明同一栽培環境下，同一規格等級的天麻樣本間各成分含量差異較大，天麻個體生長發育、主要成分轉化和積累等因天麻個體不同而存在差異，導致天麻主要成分含量個體差異較大。這為天麻品種選育和科學栽培提供了啟示。