自噬在光療治療真菌性皮膚病中的研究進展

馮健婷　湯紅峰

【摘要】 自噬被認為是機體的一種自我調節機制，對細胞和組織的動態平衡起著至關重要的作用。而真菌性皮膚病目前仍是當代社會備受關注的皮膚病之一。隨著各種醫學激光治療的廣泛應用，考慮到它全身副作用較小，便于使用，在治療真菌感染性皮膚病方面的治療中日益受到關注。現圍繞自噬在光療治療各種真菌感染性皮膚病中的作用的相關研究展開綜述。

【關鍵詞】 真菌 自噬 氧化應激 氮化應激

Advances in the Study of Autophagy in Phototherapy of Fungal Skin Diseases/FENG Jianting， TANG Hongfeng. //Medical Innovation of China， 2023， 20（12）： -168

[Abstract] Autophagy is considered as a self-survival mechanism of the organism and plays a key role in the dynamic balance of cells and tissues. And fungal dermatoses are still one of the dermatological diseases that are of great concern in contemporary society. With the widespread use of various medical laser treatments， there is an increasing interest in the treatment of fungal infectious dermatoses given their low systemic side effects and ease of use. A review of studies related to the role of autophagy in the treatment of various fungal infectious dermatoses by phototherapy is presented.

[Key words] Fungi Autophagy Oxidative stress Nitrogenative stress

First-author's address： Guangdong Medical University， Zhanjiang 524023， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.12.039

皮膚真菌感染多數是病程長、難治愈、易復發的，盡管其在世界范圍內發生率很高，但大部分發病機制仍然未知，治療效果也不盡人意，特別是深部真菌病的治療更為棘手。目前，真菌感染治療主要通過口服或者外用抗真菌藥及根據不同部位聯合用藥[1]。由于部分人因哺乳等特殊情況，在臨床上難以有效地解決這些問題，其中最主要的原因是抗真菌藥物種類的局限性[2]和耐藥性的產生[3]。因此，有必要尋找其他安全、有效的治療方法。光療作為一種新的治療手段已被廣泛地應用于醫學領域中。考慮到光療具有全身副作用少、使用方便等特點，在真菌感染性皮膚病的治療中日益受到關注。

由于利用光療對深部真菌病的研究存在一定的難度，因此目前大多數研究重點都集中于淺部的致病真菌（皮膚癬菌）中，其最易侵害人畜的皮膚角質層，寄生在表皮角質、頭發和甲板角蛋白組織，是淺表皮膚癬病的重要病因，偶爾會侵入深部組織，導致炎癥反應和肉芽腫反應。由于深部真菌病發病率高于普通人，在免疫功能低下的人群中，尤其是兒童、老人、HIV、糖尿病及腫瘤化療患者感染率升高，其中在免疫抑制患者中更為嚴重[4]。自噬一般由各種影響因素引起，例如饑餓、缺氧、氧化應激、病原體感染等。自噬機制被破壞會引發一系列包括腫瘤、神經退行性疾病、代謝相關疾病、免疫性疾病、微生物感染等方面的疾病。

1 光療在真菌性皮膚病中的應用

近年來體內外研究證明光療可以有效抑制真菌生長。Chen等[5]研究證實了亞甲藍和發光二極管（LED）635 nm體外光動力對紅色毛癬菌、須癬菌和石膏樣毛癬菌的生物膜有一定的破壞性，使之對常規抗真菌藥物變得更加敏感。Cronin等[6]單獨使用LED 280 nm透過指甲在體外照射紅毛癬菌后，培育兩周后未發現真菌生長。Carmello等[7]也發現，無論是否使用光敏劑，使用藍光（455 nm）均能體外損傷白色念珠菌的DNA。Calzavara-Pinton等[8]使用艾拉光動力療法（ALA-PDT），艾拉，外用鹽酸氨酮戊酸散，一種光敏劑，對9例由白色念珠菌、須癬菌、紅色毛癬菌所致的難治性趾間真菌病進行治療，取得了較好的療效。Mang等[9]發現光動力療法（PDT）可有效滅活從AIDS患者分離出來的耐兩性霉素B和氟康唑的白色念珠菌。Sotiriou等[10]也報道了30例用ALA-PDT治療的甲真菌病患者有43.3%的治愈率。白色念珠菌和紅毛癬菌在PDT加入三種不同的水溶性光敏劑（孟加拉紅、孔雀石綠草酸鹽及亞甲藍），加入了孟加拉紅組的兩種真菌生長程度明顯得到抑制，加入尿素和硫脲可以增強甲板的滲透性，在治療甲真菌病中有更好的療效[11]。陸晟等[12]應用長脈寬1 064 nm Nd：YAG激光共治療了79例甲真菌病患者，臨床療效率為67.1%，真菌學有效率為73.4%，復發或再感染率為19.0%。Kashiwabuchi等[13]研究發現長波紫外線（UVA）和核黃素聯合處理酵母和絲狀真菌，其形態和表型變化有一定的改變，缺乏一致性，對真菌滅活有一定的作用。這表明光療可抑制各種真菌的生長，并且有望用于治療真菌感染相關性皮膚病，盡管其作用機制尚不清楚。

2 應激刺激與真菌性皮膚病

過量的活性氧（ROS）產生可引起氧化應激（oxidative stress， OS），可導致細胞損傷和凋亡。文獻[14-15]發現，用甲苯胺藍作為光敏劑，在LED 630 nm下和紅毛癬菌混合培養后，會被引起激活菌體自身殺滅作用，且ROS、過氧化亞硝酸根離子（ONOO-）、一氧化氮（NO）顯著增加；而當波長為（417±5）nm的藍光應用在作為光敏劑的姜黃素時，ROS也顯著增加，抑制真菌生長。而Wi等[16]照射球形馬拉色菌時，也可使菌量明顯下降，ROS和脂質過氧化物顯著增加。這提示不僅是PDT，僅來自可見光譜的光線也可導致自體光敏化過程，這可能是由于已經存在于細胞內有可充當光敏劑的生物膜或組織內的內源性物質的積累，導致在病原體中誘導產生ROS[17]。

真核生物中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase， NADPH oxidase， Nox）可以誘導ROS的產生，它不僅存在于哺乳動物細胞中，還存在于真菌、植物和其他真核生物中[18]。在真菌中，4種Nox的同系物被發現，分別是：NoxA、NoxB、NoxC和高鐵還原酶（FRE）[19]。NoxA、NoxB和NoxC亞型與超氧化物產生有關，而FRE亞型則參與金屬離子的產生[20]。真菌的Nox同系物與哺乳動物的Nox有序列相似性，它們也可以產生ROS，并被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制劑二苯基氯化碘鹽（DPI）所抑制。Segmüller等[21]研究發現，NoxA和NoxB參與灰霉葡萄孢子菌的菌核形成。

NO也在不同生物體內具有多種重要作用，且真菌能夠合成NO[22]。NO可以誘導性發育并影響構巢曲霉的形態發生，這部分可能通過自體產生的ROS起作用[23]。NO也被證明參與保護食用菌菌絲體免受由熱應激誘導產生的氧化損傷[24]，但NO在過氧亞硝酸鹽（ONOO-）及其質子化形式（ONOOH）、亞硝基過氧化碳酸鹽（ONOOCO2-）和二氧化氮（NO2）細胞內過量累積會導致細胞產生各種活性氮（RNS），造成氮化應激爆發，導致細胞凋亡。哺乳動物細胞中自由基NO的主要來源是通過一氧化氮合酶（NOS）對L-精氨酸的酶氧化。雖然真菌中NO來源還沒有完全研究清楚，但有研究顯示哺乳動物NOS的抑制劑如N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）干預真菌也具有相似的抑制效果，提示真菌中也存在類似于哺乳動物的NOS[22，25]。單純光療在真菌治療效果方面，目前還未見到關于NO作用方面的研究報道。

關于ROS和NO的相互作用，有研究表明NO往往會降低人類細胞中Nox1/2的表達，從而抑制ROS的產生[26]。與哺乳動物細胞內相反，在Chen等[27]的研究中，在蕓苔屬植物中加入硒，可以通過內源性NO的增加，上調還原型輔酶Ⅱ氧化酶從而觸發植物內ROS爆發，引起毒性作用。另有研究發現，黃曲霉中加入麝香草酚可以使真菌中ROS和NO爆發，同時導致氧化應激和氮化應激，使真菌生長受到抑制，其中對麝香草酚的反應，NO的積累遠低于ROS的積累，且起始時間比ROS明顯延遲；麝香草酚存在時，用NADPH氧化酶抑制劑使ROS生成受阻，NO生成也同樣可以得到抑制，從而證明ROS是通過引起NO生成而參與麝香草酚引起真菌死亡[25]。研究表明單獨強脈沖光（intense pulsed light，IPL）420 nm治療紅毛癬菌感染患者取得顯著效果，說明IPL 420 nm可誘導ROS、NO產生，引發氧化損傷及氮化損傷的應激刺激，從而抑制了紅毛癬菌的生長[28]。由此可見，ROS與NO在哺乳動物、植物及真菌中的相互關系各有不同，可能與物種或外界干預方式不同相關，NO和ROS可造成真菌損傷，但二者的相互關系尚未明確，有必要進一步探討。

3 自噬與真菌感染性皮膚病的光療

有文獻表明應激與自噬存在一定的關系。細胞自噬，指真核生物對胞內大物質在進化上保守周轉，在維持機體平衡中發揮著極大的作用的進化過程，通過降解細胞內受損或死亡的細胞器、異常蛋白等以維持正常的細胞功能。在此過程中，被雙層膜結構的自噬小泡包裹的部分受損的蛋白質或細胞器形成自噬體，被送到溶酶體中，融合后形成自噬溶酶體進行降解并得以循環利用，以達到細胞穩態，并使細胞器不斷更新。自噬分為巨自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）三種類型，其中巨自噬也就是人們常說的自噬。自噬體是指在細胞內形成并維持自身穩定形態的一種細胞器，具有清除受損蛋白質、抑制凋亡等多種功能，對機體起著非常重要的作用。而巨自噬分為選擇性自噬（selective autophagy）和非選擇性自噬（non-selective autophagy），依賴于其對于一些特定底物的選擇性降解與否。非選擇性自噬已得到了廣泛研究，通常在特定條件下（如營養、饑餓）被誘導，用于長壽命蛋白質的大量降解[29]。選擇性自噬包括細胞質-液泡靶向（Cvt）途徑，過氧化物酶吞噬和線粒體自噬，通常靶向特定蛋白質或細胞器，由配體-受體-支架和Atg8蛋白家族組成受體蛋白復合物完成[30]。自噬發生的過程可大致分為4個部分：（1）接收自噬誘導信號之后，產生分隔膜，人微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）在分隔膜的內膜和外膜均存在，其中LC3-Ⅱ作為細胞自噬過程中一個重要的標志蛋白已被報道[31]；（2）分隔膜繼續延伸并融合，降解的底物與細胞質完全分離，形成自噬體；（3）自噬體與溶酶體的融合，形成自噬性溶酶體；（4）在多種水解酶的作用下，自噬體中的底物分子被分解成小分子，降解產物重新釋放回細胞質內，得以循環利用[32]。到目前為止，在酵母中已經被發現有大約41個與自噬相關的蛋白，這些很多在真核生物域內都有高度的保守性。Klionsky等[33]將編碼這些蛋白的基因統一命名為自噬相關基因（AuTophaGy，ATG），用以代表自噬基因及其相對應的蛋白質。

為了應對各種壓力，嚴格控制降解過程，細胞自噬在促進絲狀真菌的孢子形成、程序性細胞死亡、毒力及細胞存活方面起著重要作用，但目前真菌有關自噬的研究較少[34]，而有關光療是如何影響絲狀真菌的自噬過程更不明確。雖然國內外仍沒有研究關于自噬是否參與光療抑制真菌的作用過程，但可以推測，自噬在各種激光對真菌的抑制作用中也扮演著重要的角色，影響光療的效果。

目前，已知PDT應用于腫瘤、感染性疾病等治療，發生以下Ⅰ和Ⅱ型反應：在Ⅰ型反應中，光敏劑（PS）與生物分子之間的電子轉移導致產生有害的反應中間體，如超氧陰離子（O2-），過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH）等活性氧成分。在Ⅱ型反應中，能量轉移將PS激發成三態，產生單線態氧，它可以與一些生物分子如脂質和蛋白質反應。有研究發現，自噬在PDT抑制腫瘤細胞的過程中發揮重要作用。Wei等[35]發現通過藥物抑制劑和Atg5基因沉默抑制自噬顯著增加了PDT誘導的PROM1/CD133+含量，提示自噬具有抗凋亡的作用。Huang等[36]的研究中發現采用MPPa介導的光動力療法（MPPa-PDT）誘導的MG-63細胞凋亡被3-甲基腺嘌呤（3-MA）和氯喹（CQ）預處理削弱，提示MPPa-PDT所致的自噬對MG-63細胞凋亡具有促進作用。上述結果符合Wang等[37]報道的抑制自噬可降低YM155誘導的前列腺癌細胞的凋亡，由此可見，細胞凋亡是具有自噬依賴性的。已有研究提示自噬可以通過ROS的斷裂和凋亡的抑制來保護腫瘤細胞，而在某些情況下它可以使腫瘤細胞的自噬性死亡并促進腫瘤的抑制[38]。這提示自噬在PDT抗腫瘤作用中起雙重作用。另外，根據Abe等[39]研究發現，3-MA，一種特定的早期自噬抑制劑減少了神經膠質瘤細胞（U251 MG）中毒素誘導的細胞死亡。另一方面，晚期自噬抑制劑CQ增加了誘導的細胞死亡。

4 總結

自噬是在自噬相關的基因調控下，受損的細胞器和大分子物質被溶酶體分解，以滿足細胞本身的代謝需求及某些細胞器進行更新和修復的目的。由于激光療的廣泛應用，在不同層面廣受患者好評。但光療在真菌性皮膚病方面目前仍是個嶄新的研究領域，而自噬在真菌感染方面相關機制的探討亦是相對較少。故開展自噬在真菌性皮膚病治療方面的相關研究，特別是光療，將有助于尋找到真菌感染性疾病新的治療靶點，從而為激光廣泛應用于真菌感染性疾病的治療提供新的思路。

參考文獻

[1] EL-GOHARY M，ZUUREN E，FEDOROWICZ Z，et al.Topical antifungal treatments for tinea cruris and tinea corporis[J].Cochrane Database Syst Rev，2014，8（8）：CD009992.

[2] WANG R H，HU Y，TANG H，et al.Majocchi granuloma in a pregnant woman[J].Obstetrics & Gynecology，2014，124（2）：423-425.

[3] SACHELI R，HAYETTE M P.Antifungal resistance in dermatophytes： genetic considerations， clinical presentations and alternative therapies[J].Journal of Fungi，2021，7（11）：983.

[4] PAPINI M，DIFONZO E M，ASTE N.Mycology： an update[J].Giornale Italiano Di Dermatologia e Venereologia： Organo Ufficiale， Societa Italiana Di Dermatologia e Sifilografia，2013，148（6）：549-550.

[5] CHEN B，SUN Y，ZHANG J，et al.In vitro evaluation of photodynamic effects against biofilms of dermatophytes involved in onychomycosis[J].Frontiers in Microbiology，2019，10：1228.

[6] CRONIN L J，MILDREN R P，MOFFITT M，et al.An investigation into the inhibitory effect of ultraviolet radiation on Trichophyton rubrum[J].Lasers in Medical Science，2014，29（1）：157-163.

[7] CARMELLO J C，PAVARINA A C，OLIVEIRA R，et al.Genotoxic effect of photodynamic therapy mediated by curcumin on Candida albicans[J].FEMS yeast research，2015，15（4）：fov018.

[8] CALZAVARA-PINTON P G，VENTURINI M，CAPEZZERA R，et al.Photodynamic therapy of interdigital mycoses of the feet with topical application of 5-aminolevulinic acid[J].Photodermatology Photoimmunology & Photomedicine，2010，20（3）：144-147.

[9] MANG T S，MIKULSKI L，HALL R E.Photodynamic inactivation of normal and antifungal resistant Candida species[J].Photodiagnosis and Photodynamic Therapy，2010，7（2）：98-105.

[10] SOTIRIOU E，KOUSSIDOU-EREMONTI T，CHAIDEMENOS G，

et al.Photodynamic therapy for distal and lateral subungual toenail onychomycosis caused by Trichophyton rubrum： preliminary results of a single-centre open trial[J].Acta Derm Venereol，2010，90（2）：216-217.

[11] VALKOV A，ZINIGRAD M，NISNEVITCH M.Photodynamic eradication of Trichophyton rubrum and Candida Albicans[J].Pathogens，2021，10（3）：263.

[12]陸晟，張振，費燁，等.長脈寬Nd：YAG激光治療甲真菌病療效觀察[J].中華皮膚科雜志，2013（2）：105-108.

[13] KASHIWABUCHI R T，CARVALHO F R，KHAN Y A，et al.

Assessment of fungal viability after long-wave ultraviolet light irradiation combined with riboflavin administration[J].Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology，2013，251（2）：521-527.

[14] BALTAZAR L M，SOARES B M，CARNEIRO H C S，et al.

Photodynamic inhibition of Trichophyton rubrum： in vitro activity and the role of oxidative and nitrosative bursts in fungal death[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2013，68（2）：354-361.

[15] BALTAZAR L M，KRAUSZ A E，SOUZA A C O，et al.Trichophyton rubrum is inhibited by free and nanoparticle encapsulated curcumin by induction of nitrosative stress after photodynamic activation[J/OL].PLoS One，2015，10（3）：e0120179.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25803281/.

[16] WI H S，NA E Y，YUN S J，et al.The antifungal effect of light emitting diode on Malassezia yeasts[J].Journal of Dermatological Science，2012，67（1）：3-8.

[17] CIEPLIK F，TABENSKI L，BUCHALLA W，et al.Antimicrobial photodynamic therapy for inactivation of biofilms formed by oral key pathogens[J].Frontiers in Microbiology，2014，5：405.

[18] BEDARD K，LARDY B，KRAUSE K H.NOX family NADPH oxidases： not just in mammals[J].Biochimie，2007，89（9）：1107-1112.

[19] KIM H，CHEN C，KABBAGE M，et al.Identification and characterization of Sclerotinia sclerotiorum NADPH oxidases[J].Applied and Environmental Microbiology，2011，77（21）：7721-7729.

[20] TAKEMOTO D，TANAKA A，SCOTT B.NADPH oxidases in fungi： diverse roles of reactive oxygen species in fungal cellular differentiation[J].Fungal Genetics and Biology，2007，44（11）：1065-1076.

[21] SEGM?LLER N，KOKKELINK L，GIESBERT S，et al.NADPH oxidases are involved in differentiation and pathogenicity in Botrytis cinerea[J].Molecular Plant-Microbe Interactions，2008，21（6）：808-819.

[22] VIEIRA A L G，LINARES E，AUGUSTO O， et al.Evidence of a Ca2+-NO-cGMP signaling pathway controlling zoospore biogenesis in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii[J].Fungal Genetics and Biology，2009，46（8）：575-584.

[23] BAIDYA S，CARY J W，GRAYBURN W S，et al.Role of nitric oxide and flavohemoglobin homolog genes in Aspergillus nidulans sexual development and mycotoxin production[J].Applied and Environmental Microbiology，2011，77（15）：5524-5528.

[24] KONG W，HUANG C，CHEN Q，et al.Nitric oxide alleviates heat stress-induced oxidative damage in Pleurotus eryngii var. tuoliensis[J].Fungal Genetics and Biology，2012，49（1）：15-20.

[25] SHEN Q，ZHOU W，LI H，et al.ROS involves the fungicidal actions of thymol against spores of Aspergillus flavus via the induction of nitric oxide[J/OL].PLoS One，2016，11（5）：e0155647.https：//www.researchgate.net/publication/303380498_ROS_Involves_the_Fungicidal_Actions_of_Thymol_against_Spores_of_Aspergillus_flavus_via_the_Induction_of_Nitric_Oxide.

[26] HARRISON C B，DRUMMOND G R，SOBEY C G，et al.

Evidence that nitric oxide inhibits vascular inflammation and superoxide production via a p47phox-dependent mechanism in mice[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2010，37（4）：429-434.

[27] CHEN Y，MO H Z，HU L B，et al.The endogenous nitric oxide mediates selenium-induced phytotoxicity by promoting ROS generation in Brassica rapa[J/OL].PLoS One，2014，9（10）：e110901.https：//journals.plos.org/plosone/article？id=10.1371/journal.pone.0110901.

[28]黃昊.強脈沖光420nm對紅色毛癬菌的干預作用[D].廣州：南方醫科大學，2017.

[29]關夢琦，崔巖，李珊山.LC3相關吞噬作用在真菌感染中的作用機制研究進展[J].中國真菌學雜志，2021，16（3）：207-210.

[30] MIJALJICA D，NAZARKO T Y，BRUMELL J H，et al.

Receptor protein complexes are in control of autophagy[J].Autophagy，2012，8（11）：1701-1705.

[31] TAM J M，MANSOUR M K，ACHARYA M，et al.The role of autophagy-related proteins in Candida albicans infections[J].Pathogens，2016，5（2）：34.

[32] XIE Z，KLIONSKY D J.Autophagosome formation： core machinery and adaptations[J].Nature Cell Biology，2007，9（10）：1102-1109.

[33] KLIONSKY D J，CREGG J M，DUNN W A，et al.A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes[J].Developmental Cell，2003，5（4）：539-545.

[34] SUMITA T，IZUMITSU K，TANAKA C.Characterization of the autophagy-related gene BmATG8 in Bipolaris maydis[J].Fungal Biology，2017，121（9）：785-797.

[35] WEI M F，CHEN M W，CHEN K C，et al.Autophagy promotes resistance to photodynamic therapy-induced apoptosis selectively in colorectal cancer stem-like cells[J].Autophagy，2014，10（7）：1179-1192.

[36] HUANG Q，OU Y S，TAO Y，et al.Apoptosis and autophagy induced by pyropheophorbide-α methyl ester-mediated photodynamic therapy in human osteosarcoma MG-63 cells[J].Apoptosis，2016，21：749-760.

[37] WANG Q，CHEN Z，DIAO X，et al.Induction of autophagy-dependent apoptosis by the survivin suppressant YM155 in prostate cancer cells[J].Cancer Letters，2011，302（1）：29-36.

[38] GEWIRTZ D A.The four faces of autophagy： implications for cancer therapy autophagy and cancer therapy[J].Cancer Research，2014 ，74（3）：647-651.

[39] ABE A，KOKUBA H.Harmol induces autophagy and subsequent apoptosis in U251MG human glioma cells through the downregulation of survivin[J].Oncology Reports，2013，29（4）：1333-1342.

（收稿日期：2023-03-06） （本文編輯：張明瀾）