超高效液相色譜法同時測定紅芪和黃芪藥材中有效成分含量*

焦 潔，郭建博，鄭 旭，胡萌萌，蔡 虎

（陜西省食品藥品檢驗研究院·國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西西安 710065）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge 的干燥根，是內蒙古和甘肅道地藥材。紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrysHand. - Mazz. 的干燥根，是甘肅道地藥材。二者為同科不同屬藥材，均有補氣升陽、利水消腫、止汗、托毒排膿及斂瘡生肌功效［1］，但主要成分及藥理作用存在差異。在皂苷類和黃酮類成分方面，黃芪、紅芪分別已分離出125，21個化合物。黃芪主要有細胞免疫、降血糖、保護心腦血管、改善腎功能等作用，紅芪主要有抗骨質疏松、抗腫瘤、抗炎等作用，且二者均有抗免疫、抗衰老、免疫調節等藥理作用［2-4］。目前，紅芪的相關研究報道和臨床應用遠少于黃芪。本研究中探討了紅芪、黃芪藥材的共有成分和特有成分，為二者的對比分析及紅芪藥材的推廣提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；SK5200GT 型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；MS430TS 型電子天平、XPE205 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司）；Merck Milli-Q超純水儀（默克化工技術<上海>有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮對照品（批號為DST190915012，含量≥98%），芒柄花苷對照品（批號為DST190711044，含量≥98%），均購于成都德斯特生物技術有限公司；毛蕊異黃酮苷對照品（批號為111920 - 201505，含量≥97.1%），阿魏酸對照品（批號為110773 -201614，含量≥99%），異阿魏酸對照品（批號為111698-201103，含量≥99.2%），香草酸對照品（批號為110776-201503，含量≥99.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；蒙古黃芪（隴海藥材有限責任公司，批號為120974 - 202011），武都紅芪（隴南同人紅芪購銷有限責任公司，批號為20200805），均經陜西中醫藥大學中藥資源教研室王西芳教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18柱（200 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min 時8%A→13% A，1～10 min 時13%A，10～15 min 時13%A→20%A，15～18 min 時20%A→23%A，18～23 min 時23%A →20%A，23～25 min 時20%A→13%A，25～27 min 時13%A→8%A）；流速：0.2 mL/min；檢測波長：250 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

取香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷對照品各適量，精密稱定，用甲醇制成質量濃度分別為403.19，436.59，466.24，488.04，400.82，404.91 μg/mL 的混合對照品溶液。取紅芪、黃芪藥材樣品粉末各3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30 mL 甲醇，超聲（功率250 W，頻率43 kHz）處理30 min，取出，濾過，用甲醇少量多次沖洗殘渣，濃縮，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經0.2 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液Ⅰ和Ⅱ［4］。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2項下溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，表明方法系統適用性良好。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜圖1.Vanillic acid 2.Ferulic acid 3.Calycosin-7-glucoside 4.Isoferulic acid 5.Ononin 6.Calycosin A.Mixed reference solution B.Test solution Ⅰ C.Test solution ⅡFig.1 UPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液各適量，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得系列混合對照品溶液；取適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表1。

表1 線性關系及定量限、檢測限考察結果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of quantitation and limit of detection

檢測限與定量限考察：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以信噪比（S/N）為3 和10 時的待測成分質量濃度為檢測限和定量限，結果見表1。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果香草酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、異阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮峰面積的RSD分別為1.21%，0.83%，0.52%，0.76%，0.65%，1.02%，均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果前述6種成分峰面積的RSD分別為2.02%，2.63%，4.81%，4.54%，3.18%，4.36%，均小于5.0%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：稱取同一批紅芪藥材樣品3 g，各6 份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果前述6種成分含量的RSD分別為3.05%，3.32%，2.12%，2.73%，2.56%，3.55%，均小于5.0%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量的紅芪藥材樣品約1.5 g，精密稱定，平行6 份，置具塞錐形瓶中，加入一定質量濃度的混合對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取紅芪、黃芪藥材樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各待測成分含量，結果見表3（-為未測出）?？梢?，黃芪、紅芪藥材的3 種共有成分含量差異較大，黃芪藥材中毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮含量約分別為紅芪藥材的16 倍和5 倍，紅芪藥材中芒柄花苷含量約為黃芪藥材的4倍。

表3 藥材樣品含量測定結果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of six components in medicinal material samples（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 樣品處理

黃芪與紅芪藥材樣品的提取一般多采用回流提取法，部分采用萃取法，并應用蒸發光檢測器測定［5］。預試驗中考察了甲醇（回流法、超聲法）提取、乙醇（回流法、超聲法）提取，發現以甲醇為溶劑的提取效果較佳，加熱回流提取法和超聲提取法的提取效果相差不大?？紤]到超聲提取操作簡單，溶劑損耗少、耗費時間短，故選擇甲醇超聲提取；同時考察了提取溫度、提取時間、提取次數對提取效果的影響，結果當提取溫度為25 ℃、提取時間為30 min、提取1 次時，提取效果最佳。

3.2 檢測波長選擇

通過查閱相關文獻及UPLC 全波長色譜掃描圖譜分析，測得紅芪藥材中有機酸類及黃酮類成分的最佳檢測波長分別約為280，250，230 nm［6-8］。通過對比分析，紅芪藥材有效成分在250 nm 波長處峰形較好、分離度及響應度也較高，故以250 nm為檢測波長。

3.3 樣品含量測定

本研究結果顯示，紅芪、黃芪藥材的共有成分為芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷。黃芪藥材中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷的含量顯著高于紅芪藥材，紅芪藥材中芒柄花苷含量顯著高于黃芪藥材。文獻［9］顯示，黃芪藥材中各黃酮類成分含量均高于紅芪藥材，與本研究結果存在差異，分析原因可能為各藥材產地、采收年限、生長環境、生產加工等存在差異［10-12］，但該差異不影響藥材對比研究方法的確定。

3.4 圖譜分析

本研究結果顯示，在同一色譜條件下可同時測定紅芪藥材中香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷6種有效成分及黃芪藥材中芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷3種成分的含量，且峰形較好、分離度較高，表明此色譜條件可用于2 種藥材的單指標及多指標成分對比分析。且黃芪藥材樣品中其余色譜峰峰形也較好，后期可作進一步研究。

本研究可為相近種屬藥材成分的對比研究提供研究思路，可采用同一條件進行單一藥材多成分研究與2 個及以上藥材多指標成分對比研究，研究范圍相對廣泛。本研究中對黃芪與紅芪藥材的有效成分進行了定量比較研究，以期為二者的臨床應用提供理論依據，以更好地促進和推動中藥黃芪和紅芪資源的合理利用［13-16］。

綜上所述，本研究中所建立的方法可靠，操作簡單，可為后期紅芪及黃芪藥材的質量控制提供參考。