正交試驗優(yōu)選吳茱萸湯提取工藝*

安中原，陳育煌，余 巧，申 茹，毛一中

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院·廣東省惠州市藥用植物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東惠州 516025）

吳茱萸湯出自東漢張仲景的《傷寒論》，由吳茱萸、生姜、人參和大棗組方，具有暖肝溫胃、降逆止嘔功效［1］。該方可改善機體脾胃虛寒或肝經(jīng)寒氣上逆，具有止嘔、抗消化道潰瘍、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用［2-5］，臨床廣泛用于胃炎、胃痛、胃食管反流、嘔吐等消化系統(tǒng)疾病的治療［6-9］。將吳茱萸湯開發(fā)成胃內(nèi)漂浮片，可避免煎劑使用不便、不易攜帶和儲存等缺點，還能延長藥物在胃內(nèi)停留和釋放的時間，提高其生物利用度。吳茱萸堿和吳茱萸次堿是吳茱萸湯的活性成分［10］，可作為其質(zhì)量控制指標。為使處方藥材中活性成分提取最大化，本研究中采用正交試驗法，以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的綜合得分為評價指標，優(yōu)化吳茱萸湯的提取工藝，為其胃內(nèi)漂浮片的制備提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；FA2004N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司，精度為0.1 mg）；JA3003 型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，精度為1 mg）；KQ - 500VSM 型雙頻靜音型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；B -220 型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；Direct -PureRO 10型純水儀（上海樂楓生物科技有限公司）。

1.2 試藥

吳茱萸堿對照品（批號分別為BWB50890和210818）、吳茱萸次堿對照品（批號分別為BWB50892和211017），均購自北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司，含量均大于98%；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸、乙醇均為分析純，水為超純水。吳茱萸（批號為201101）、人參（批號為20210405）、大棗（批號為210301）分別產(chǎn)于廣西、遼寧、新疆，均購自惠州市百姓大藥房醫(yī)藥連鎖有限公司，生姜（沃爾瑪< 廣東> 商業(yè)零售有限公司港惠新天地店< 惠州> ，批號為202108），經(jīng)惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院毛一中教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸堿與吳茱萸次堿含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ThermoODS-2Hypersil柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈- 甲醇- 0.1%磷酸水溶液（30∶32∶38，V/V/V）；流速：1 mL/ min；檢測波長：225 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品0.009 9，0.011 2 g，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品貯備液，精密吸取2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液：按吳茱萸湯處方及工藝取藥材飲片樣品（吳茱萸9 g、生姜18 g、人參9 g、大棗12 枚），精密稱定。吳茱萸和人參藥材飲片樣品粉碎，過2號篩；生姜和大棗（去核）切碎，加入70%乙醇（1∶20、m/V，下同）回流提取2 次，每次0.5 h，合并濾液，置3 000 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按吳茱萸湯處方及工藝制備缺吳茱萸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.1.2 項下3 種溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜在與混合對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰且分離度高，陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Evodiamine 2.Rutecarpine A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取吳茱萸堿及吳茱萸次堿對照品溶液各適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為7.9，9.9，19.8，39.6，79.2，198 μg/ mL 和3.58，4.48，11.2，22.4，44.8，89.6 μg/ mL 的系列對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標、待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得吳茱萸堿回歸方程Y1=69.835X1-0.828 7（R2=0.999 9，n=6）和吳茱萸次堿回歸方程Y2=60.406X2+59.497（R2=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，吳茱萸堿、吳茱萸次堿質(zhì)量濃度分別在7.9～198 μg/mL 和3.58～89.6 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：分別精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液10 μL，按2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為0.57%和0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為1.13%和1.45%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批藥材樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1.1項下色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均含量分別為8.78 mg/g和4.12 mg/g，RSD分別為2.32%和1.83%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量的處方量藥材適量，共9 份，每3 份為1 組，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.1.4 樣品含量測定

取樣品適量，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定3 次，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均含量分別為8.85 mg/g和4.14 mg/g。

2.2 吳茱萸湯提取工藝優(yōu)選

2.2.1 提取方法考察

按處方量稱取藥材6 份，采用超聲法、乙醇回流法提取時均加入70%乙醇（1∶20，m/V），水煮法提取時加水；提取時間均為1 h，均提取1 次，濾過，置2 000 mL 容量瓶中，分別加70%乙醇或水定容，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。綜合評分=吳茱萸堿含量×0.65（權(quán)重）+吳茱萸次堿含量×0.35（權(quán)重）。結(jié)果3種方法綜合評分分別為4.69分、5.04分、2.19分，故選擇乙醇回流法提取。

2.2.2 正交試驗

以乙醇體積分數(shù)（因素A）、料液比（因素B）、提取時間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）為考察因素，以吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的綜合評分為評價指標，采用L9（34）正交試驗法優(yōu)選吳茱萸湯提取工藝。因素與水平見表2，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

表3 L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the ANOVA

可見，各因素對綜合評分的影響大小依次為A>D>B>C。由表4 可知，4 個因素對結(jié)果均無顯著影響，從節(jié)能增效角度看，最后得吳茱萸湯的最佳提取工藝為A2B3C1D2，即加70%乙醇，料液比為1∶20（m∶V），提取時間為0.5 h，提取2次。

2.2.3 驗證試驗

取10 倍吳茱萸湯處方量藥材，平行3 份，按上述最佳提取工藝參數(shù)進行驗證試驗。結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。詳見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the verification test（n=3）

3 討論

3.1 處方藥材量選取

吳茱萸湯處方用量，《傷寒雜病論》中記載為“吳茱萸一升（洗，辛熱），人參三兩（甘溫），生姜六兩（切，辛溫），大棗十二枚（擘，甘溫）。上四味，以水七升，煮取二升，去滓”；《方劑學》［11］中記載為“吳茱萸9 g、人參9 g、生姜18 g、大棗12枚”。根據(jù)相關(guān)臨床資料，本研究中選擇后一劑量。大棗在處方中無嚴格定量，且由于市場中紅棗大小不一，可能影響料液比，參考文獻［12］按單枚紅棗（去核）質(zhì)量3 g，折算本方中大棗質(zhì)量為36 g。

3.2 色譜條件選擇

吳茱萸為方中君藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功，吳茱萸堿和吳茱萸次堿是其活性成分。本研究中對吳茱萸堿和吳茱萸次堿進行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿的最大吸收波長為225 nm，吳茱萸次堿的最大吸收波長為330 nm，在225 nm 波長處也有明顯吸收，故選擇225 nm 作為檢測波長。采用高效液相色譜法測定2 種有效成分含量，預試驗中考察不同系統(tǒng)和比例的流動相，如0.1%磷酸水溶液（含十二烷基硫酸鈉0.2%）- 甲醇- 乙腈［13］、乙腈水溶液［14］等，最后確定流動相采用乙腈- 甲醇- 0.1%磷酸水溶液（30∶32∶38，V/V/V）。在此條件下，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的保留時間短，分離度高，同時能避免其他組分的干擾。

3.3 提取工藝優(yōu)選

本研究中考察了分別采用超聲法、回流法、水煮法對提取效果的影響，結(jié)果顯示，乙醇回流法提取活性成分含量更高，超聲法次之，水煮法最低，與吳茱萸湯活性成分醇溶性較高有關(guān)［15］；且方中生姜的主要成分為揮發(fā)油性物質(zhì)，人參和大棗的主要成分為水不溶性物質(zhì)［16］，水煮法不利于上述活性成分的溶出。故最終采用乙醇回流法提取。

綜上所述，本研究中優(yōu)選的工藝操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定，可用于吳茱萸湯的提取。