交泰丸對復(fù)合刺激致失眠大鼠GFAP 和S100B 的影響*

郭昕子，曾雪愛，周春權(quán)，黃俊山

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福建福州 350122

2 福建省中醫(yī)藥科學(xué)院 福建福州 350003

隨著現(xiàn)代社會(huì)壓力的增加，失眠患者越來越多，甚至出現(xiàn)許多并發(fā)癥[1]，嚴(yán)重影響日常工作和生活。交泰丸有清上溫下、安神定志的功效[2]，是治療心腎不交型失眠的經(jīng)典方，但其治療失眠的機(jī)制尚不明確。有研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，AC）可通過調(diào)控神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性、調(diào)節(jié)突觸可塑性[3]、釋放活性分子[4]等途徑參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，在睡眠-覺醒周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是AC 的骨架蛋白，有研究表明其僅在AC 的胞體中表達(dá)，血清中GFAP 可能來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5]。S100 鈣結(jié)合蛋白B（S100 calcium-binding protein B，S100B）由AC 分泌[4]，其適度表達(dá)有利于保護(hù)受損腦部，而過度表達(dá)會(huì)加重疾病對腦部的損傷[6]。故本研究通過多因素刺激+腹腔注射對氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA）建立失眠模型，觀察交泰丸對失眠大鼠血清和基底前腦GFAP 和S100B 的影響，探討交泰丸改善失眠的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠28 只，體質(zhì)量（230±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK（閩）2016-0005，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，恒溫（25±1）℃、相對濕度50%～60%、12/12h 明暗光照。本研究經(jīng)福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：FJATCM-IAEC2020022。

1.2 藥品與試劑 中藥飲片購自福州鷺燕藥業(yè)股份有限公司；艾司唑侖（常州四藥制藥有限公司，批號(hào)：20180813）。PCPA（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：7424-00-2）；GFAP（批 號(hào)：CSB-E 08602r）、S100B（批號(hào)：CSB-E08066r）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司；GFAP 兔抗大鼠單克隆抗體（美國Cell Signaling TECHNOLOGY 公司，貨號(hào)：80788），S100B 兔抗大鼠單克隆抗體（武漢ABclonal Technology 公司，貨號(hào)：A19108）。

1.3 儀器 Sorvall Legend Micro 17R 型冷凍高速離心機(jī)（德國Thermo Fisher SCIENTIFIC 公司；Elx800TS型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；蛋白電泳槽和電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）；FluorChem M型Alpha多色熒光、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 失眠模型建立 28 只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、交泰丸組、西藥組，每組7 只。正常組正常飼養(yǎng)，其余三組參考文獻(xiàn)[7]方法，在腹腔注射PCPA 的基礎(chǔ)上，采用多因素刺激共同作用制備失眠模型。所有動(dòng)物每天同時(shí)接受同一種刺激，隨機(jī)刺激包括以下7 種：四肢束縛2 h、4℃冰水游泳5 min、夾尾1min、禁食禁水24 h、鼠籠傾斜45°24 h、晝夜顛倒24 h、潮濕墊料24 h。采用Excel 隨機(jī)數(shù)字法產(chǎn)生如下刺激順序：4℃冰水游泳5min、四肢束縛2h，鼠籠傾斜45°24h、夾尾1min、潮濕墊料24h、晝夜顛倒24h、禁食禁水24h、鼠籠傾斜45° 24h、4℃冰水游泳5min、夾尾1min、禁食禁水24h、晝夜顛倒24h、四肢束縛2h、潮濕墊料24h。14d 多因素刺激結(jié)束后，除正常組外，其余三組以10 mL/（kg·d）腹腔注射3%PCPA 混懸液[300 mg/（kg·d）]，正常組腹腔注射等體積弱堿性生理鹽水，1次/d，共2d。在最后一次注射PCPA 后，與正常組大鼠比較，其余組大鼠進(jìn)食減少、飲水增加、毛發(fā)稀疏、易激惹、白天活動(dòng)增多、晝夜節(jié)律消失，提示造模成功[7]。

2.2 給藥方法 交泰丸組成：黃連10 g，肉桂1 g。給藥劑量按大鼠與成人給藥劑量換算[8]。藥物經(jīng)煎煮及過濾濃縮后獲得濃度為0.11g/mL 的交泰丸藥液，4℃保存。艾司唑侖片由純凈水配制為0.1mg/mL 的艾司唑侖藥液，4℃保存。造模結(jié)束后交泰丸組給予交泰丸藥液，西藥組給予艾司唑侖藥液，空白組和模型組給予蒸餾水，均以10mL/（kg·d）灌胃，1 次/d，共7d。

2.3 一般狀態(tài)觀察 于第16 天和第23 天觀察大鼠進(jìn)食量、飲水量、皮膚毛發(fā)、活動(dòng)程度、精神狀態(tài)、晝夜節(jié)律。

2.4 記錄各組大鼠體質(zhì)量變化 第16 天至第23 天每天記錄大鼠體質(zhì)量，給藥前、后體質(zhì)量增量=末次給藥（第23 天）體質(zhì)量 - 造模后（第16 天）體質(zhì)量。

2.5 ELISA 法檢測血清GFAP 和S100B 含量 各組大鼠末次給藥2h 后，用2. 5%戊巴比妥鈉 （50 mg/kg）腹腔注射麻醉后取腹主動(dòng)脈血，室溫條件下血液靜置2 h 后離心（3500r/min，15min），取血清置于-80℃冰箱備用。采用ELISA 法檢測血清GFAP 和S100B 含量，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

2.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測基底前腦GFAP 蛋白相對表達(dá)量 末次給藥2h 后，腹主動(dòng)脈采血結(jié)束立即斷頭，取出大鼠腦組織，冰上分離出大鼠基底前腦，基底前腦用RIPA 蛋白裂解液（含PMSF、蛋白酶抑制劑）進(jìn)行裂解，4℃搖床上裂解30min，4℃下12000rpm/min 離心10min，吸取上清液獲取總蛋白。用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，98℃變性蛋白10min，SDSPAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉10min，4℃孵育一抗過夜，TBST 洗10min×3 次，室溫孵育二抗1h，TBST 洗10min×3 次，曝光顯影，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games-Howell 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)觀察

正常組大鼠毛發(fā)順滑有光澤，進(jìn)食量、飲水量正常，體質(zhì)量增加，日間活動(dòng)較少，多蜷臥，夜間活動(dòng)較多，精神狀態(tài)良好，晝夜節(jié)律明顯。與正常組比較，模型組進(jìn)食量減少、飲水量增加，大鼠毛發(fā)稀疏無光澤，白天活動(dòng)增多，易激惹，晝夜節(jié)律消失。交泰丸組和西藥組大鼠進(jìn)食量、飲水量增加，毛發(fā)增多且恢復(fù)光澤，白天睡眠增加，夜晚活動(dòng)增多，精神狀態(tài)明顯改善，晝夜節(jié)律恢復(fù)。

2 各組大鼠給藥前、后體質(zhì)量增量比較

與正常組比較，模型組體質(zhì)量增加緩慢（P＜0.01）。與模型組比較，交泰丸組和西藥組大鼠體質(zhì)量增量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠給藥前、后體質(zhì)量增量比較

3 各組大鼠血清GFAP 及S100B 含量比較

與正常組比較，模型組大鼠血清GFAP 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，交泰丸組和西藥組大鼠血清GFAP 含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠血清S100B 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，交泰丸組、西藥組大鼠血清S100B 含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠血清GFAP 含量比較

圖3 各組大鼠血清S100B 含量比較

4 各組大鼠基底前腦GFAP、S100B 蛋白相對表達(dá)量比較

與正常組比較，模型組大鼠基底前腦GFAP、S100B 蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，交泰丸組和西藥組大鼠基底前腦GFAP、S100B 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠基底前腦GFAP 蛋白相對表達(dá)量比較

圖5 各組大鼠基底前腦S100B 蛋白相對表達(dá)量比較

討 論

《景岳全書》中有相關(guān)記載：“真陰精血不足，陰陽不交，而神有不安其室耳”。中醫(yī)認(rèn)為，人體內(nèi)心腎失交，水火失調(diào)，陰陽失衡，易致失眠[9]，出現(xiàn)焦慮、煩躁等不良情緒。韓飛霞在《韓式醫(yī)通》中提出用交泰丸治療不寐，方由黃連和肉桂組成，黃連苦寒，歸心經(jīng)，泄心火以降心陽亢盛，使心火下達(dá)于腎；肉桂辛熱，歸心、腎經(jīng)，溫腎補(bǔ)陽以滋腎水，使腎陰上濟(jì)于心。方中黃連與肉桂配伍，一陰一陽，一寒一熱，一清一溫，共奏交通心腎，調(diào)神定志之效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃連中的黃連堿與小檗堿[10-11]、肉桂中的肉桂醛與肉桂酸[12]可抑制中樞神經(jīng)功能，有鎮(zhèn)靜催眠作用，有助于改善失眠癥狀。有研究[13]證實(shí)交泰丸中當(dāng)黃連與肉桂藥量比為10：1 時(shí)，治療失眠的療效最佳。

大腦不同腦區(qū)可通過多種生物學(xué)機(jī)制調(diào)控睡眠-覺醒活動(dòng)，基底前腦在腦內(nèi)起到傳遞信息的作用。基底前腦接收丘腦和腦干部位促覺醒網(wǎng)狀上行激活系統(tǒng)的信息后，投射至大腦皮質(zhì)[14]。有研究證實(shí)，基底前腦的膽堿能神經(jīng)元可促進(jìn)覺醒活動(dòng)，中斷基底前腦對皮質(zhì)的投射后，覺醒活動(dòng)就會(huì)隨之消失[15]。

AC 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)細(xì)胞，對正常睡眠和認(rèn)知功能有重要調(diào)節(jié)功能[16]，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，AC 會(huì)應(yīng)激性活化、增生[17]。GFAP 作為AC 活化標(biāo)志物，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病過程中通常表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，表明AC 處于應(yīng)激狀態(tài)，即神經(jīng)元受損。

研究發(fā)現(xiàn)，AC 還通過釋放信號(hào)分子以調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)[18]。AC 可釋放S100B、三磷酸腺苷、谷氨酸等神經(jīng)活性分子參與調(diào)節(jié)睡眠功能[4]，S100B 經(jīng)AC以旁分泌或自分泌產(chǎn)生，在腦損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，但其過度表達(dá)會(huì)加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷情況[6]，所以S100B 成為反映神經(jīng)細(xì)胞損傷的另一有效指標(biāo)。失眠狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)興奮，產(chǎn)生興奮毒性作用，進(jìn)而損傷神經(jīng)細(xì)胞，S100B 的血清水平可以反應(yīng)神經(jīng)受損程度[19]。

課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)交泰丸可恢復(fù)失眠大鼠的血清ACTH 水平，并增加大鼠的睡眠總時(shí)長，改善睡眠剝奪大鼠的睡眠質(zhì)量[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在失眠過程中，基底前腦和血清中GFAP 與S100B 可能發(fā)生相應(yīng)病理變化。通過多因素刺激+PCPA 復(fù)合刺激建立心失眠大鼠模型，給予交泰丸治療進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在失眠大鼠血清中GFAP、S100B 含量與基底前腦內(nèi)GFAP 和S100B 蛋白相對表達(dá)顯著升高，表明發(fā)生失眠時(shí)，大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞受損，AC 可能反應(yīng)性增長與活化，同時(shí)應(yīng)激性分泌S100B。在給予交泰丸治療7 d 后，大鼠精神狀態(tài)明顯改善，體質(zhì)量顯著增加，晝夜節(jié)律恢復(fù)，血清及基底前腦GFAP、S100B 表達(dá)水平均顯著降低，提示交泰丸有助于恢復(fù)失眠大鼠血清和基底前腦GFAP、S100B 水平，減輕大腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，從而調(diào)節(jié)失眠大鼠的睡眠功能。

綜上所述，交泰丸可能通過降低GFAP、S100B 表達(dá)水平，中斷應(yīng)激狀態(tài)，從而穩(wěn)定睡眠內(nèi)環(huán)境，減輕失眠帶來的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損狀況，因此對心腎不交型失眠有一定治療作用。