赤茵合劑治療慢性乙型肝炎作用機制探討*

趙芬芬，施衛兵，齊春偉，許文彬，馬翠翠，郭錦晨

1 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230012

2 安徽中醫藥大學 安徽合肥 230031

3 新安醫學教育部重點實驗室 安徽合肥 230038

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由HBV 病毒持續性感染而發生的慢性肝臟炎性損害病變，會發生不同程度的肝損傷，最終發展為肝硬化、肝癌等，威脅人類生命健康。目前臨床上尚無能完全治愈CHB 的特效藥[1]，所以抗病毒仍是治療CHB 的主要方法[2]，但存在耐藥風險、不良反應等相關問題，影響療效，遠期預后不佳[3]。

現代中醫學認為CHB 是由濕熱之邪侵入人體，人體正氣不足無力抗邪而起，常將CHB 歸于中醫學的“脅痛”“黃疸”等中醫疾病范疇。赤茵合劑為安徽省中醫院的自擬方，曾用名赤茵糖漿，臨床應用近30 年，療效確切。曹承樓等人[4]的研究發現，赤茵合劑對黃疸型病毒性肝炎肝膽濕熱型有明顯的治療作用。研究表明，赤茵合劑可有效降低肝內膽汁淤積性黃疸患者血清 ALT、GGT、ALP 的水平，降低肝內膽汁淤積性黃疸患者的血清LN、C-IV 水平，對改善肝組織纖維化也有良好的效果[5]。楊小軍、施衛兵、胡大慶等[6-8]人的研究證實了赤茵合劑對慢性乙型黃疸性肝炎、慢性乙型肝炎高膽紅素血癥及淤膽型乙型肝炎均有良好的治療效果。然而，赤茵合劑治療CHB 的作用機制尚未完全明確。本研究基于網絡藥理學和分子對接的方法，分析赤茵合劑治療CHB 的有效成分、作用靶點及信號通路，探究赤茵合劑治療CHB 的潛在作用機制，為臨床應用赤茵合劑治療CHB 提供理論支持。

資料與方法

1 篩選赤茵合劑有效成分及靶點

高口服生物利用度是確定生物分子作為治療劑的藥物樣特性的關鍵性指標，借助中藥系統網絡藥理學數據分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/），設置篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥40%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，獲取赤茵合劑藥物活性成分和相對應的靶點，同時采用Uniprot 數據庫規范靶點名稱。

2 篩選CHB 靶點

進 入GeneCards 數 據 庫（https：//www.genecards.org/），將“Chronic hepatitis B”作為關鍵詞進行檢索，以得分＞中位數13.60 為標準篩選，通過OMIM 數據庫（http：//www.omim.org/）、DrugBank 數據庫（https：//go.Drugbank.com/）、TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）及PharmGkb 數據庫，將“Chronic hepatitis B”作為關鍵詞，進行檢索，得到各數據庫相應的CHB 靶點，將五個數據庫的靶點合并后去重即為CHB 的靶點。將藥物與疾病靶點對比分析，獲得赤茵合劑治療CHB的潛在靶點。

3 構建分析“赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-CHB”網絡

建立潛在靶點、有效成分相關文件，將其導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建“赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-慢性乙型肝炎”網絡，并對網絡進行相關分析。

4 構建蛋白質與蛋白質之間的相互作用關系網絡（PPI），篩選核心靶點

借 助STRING 在 線 數 據 庫（https：//stringdb.org/），導入潛在靶點，限定研究物種為“Homo sapiens”，進行蛋白質互作分析，置信度設為≥0.400，隱藏游離節點，獲得PPI 網絡，保存為TSV 文件，并將其導入Cytoscape3.7.2 軟件，優化相關網絡圖，利用MCODE 插件進行聚類，并分析篩選出核心靶點。

5 GO 功能富集和KEGG 通路分析

將“1.2”中的潛在靶點上傳至Matescape 數據庫（https：//Matescape.ncifcrf.gov/），以“Homo sapiens”為限定條件，進行GO 功能富集和KEGG 通路分析。其中GO 重點了解靶點主要的作用過程，而KEGG 主要了解細胞的生化過程，最后使用微生信將結果可視化。

6 分子對接驗證

將核心靶點作為分子對接的受體，在PDB 數據庫中下載相應的pdb 格式，運用pymol 軟件進行去除水分子和原有配體，得到相應的受體結構；Pubchem 中下載的活性成分的3D 結構作為小分子配體。然后準備PDBQT 文件，根據靶點口袋調整 Gridbox 坐標及大小，采用AutoDock Vina 進行分子對接，借助PyMol、LigPlot+軟件進行可視化處理。

結 果

1 赤茵合劑有效成分及靶點與CHB 靶點收集

通過“1”中的條件在TCMSP 數據庫檢索，收集到有效成分：赤芍17 個，茵陳10 個，丹參43 個，苦參38 個，大黃11 個，葛根3 個，甘草69 個。去除重復成分、剔除無法預測相關靶點的化合物，最終確定赤茵合劑有效成分150 個，將每味中藥位于前5 的化合物列出（表1）。通過查閱文獻可知芍藥內酯苷為赤芍的主要成分，木犀草素為茵陳的主要成分，故將此2 種化合物納入，通過Pubchem、SwissTargetPrediction 數據庫篩選相關靶點，運用Uniport 數據庫校正靶點，去除重復基因并刪除非人源性靶點。最終得到152 個有效成分，351 個靶點。

表1 赤茵合劑有效活性成分基本信息

進入GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、DrugBank數據庫、TTD 數據庫及PharmGkb 數據庫，將“chronic hepatitis B”作為關鍵詞，進行檢索，將五個數據庫的靶點合并去重后獲得1113 個與CHB 相關的靶點。

將赤茵合劑有效成分對應的351 個藥物靶點與CHB 對應的1113 個疾病靶點進行對比分析后獲得127 個共有靶點，即為赤茵合劑作用于CHB 發揮治療作用的潛在靶點（圖1），其中槲皮素（Quercetin）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）、丹參酮IIA（Tanshinone IIA）、芒柄花黃素（Formononetin）Degree 值排名靠前（圖2），認為可能是發揮作用的主要成分。

圖1 藥物-疾病共同靶點

圖2 化合物Degree 值

2 “ 赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-CHB”網絡的構建及分析

建立潛在靶點、有效成分與中藥、疾病的相關文件，將其導入Cytoscape3.7.2，構建“中藥-有效成分-潛在靶點-CHB”可視化網絡圖（圖3）。

圖3 “赤茵合劑-有效成分-潛在靶點-CHB”網絡圖

3 PPI 網絡構建及核心靶點篩選

將127 個潛在靶點導入STRING 數據庫，導出TSV 格式文件，再將其導入Cytoscape3.7.2 軟件，利用“Network Analyzer”進行蛋白網絡互作分析，構建可視化網絡圖（圖4）。CytoHubba 可以準確地篩選出網絡中的重要節點，其中最大集團中心度（maximal cliquecentrality，MCC）算法被證實是預測重要靶點較為精確的方法之一。通過MCC 算法，確定的關鍵靶點即為赤茵合劑治療CHB 的核心靶點（圖5），并根據degree 值繪制條形圖（圖6），再運用Cytoscape3.7.2中的MCODE 插件，對交集靶點進行聚類功能模塊分析，共得到6 個功能模塊（圖7A-圖7F），并對其進行打分（圖8），模塊1-3 的MCODE 聚類得分分別為53.5 分、6 分和3.333 分。第一類由65 個靶點組成，是MCODE 集群得分最高的功能模塊，該模塊的靶基因主要富集在病毒感染、免疫、和癌癥相關的通路中；第2 類包含23 個靶點，涉及蛋白質磷酸化、激酶活性的調節、有絲分裂細胞周期相變、凋亡信號通路的調控等生物過程；第3 類包含4 個靶點，與外源代謝和分解過程、雌激素代謝過程、不飽和脂肪酸代謝過程相關。

圖4 PPI

圖5 核心靶點

圖6 核心靶點Degree 值

圖7 交集靶點功能模塊圖

圖8 模塊評分

4 GO 功能富集分析

利用PANTHER 在線平臺，對127 個潛在靶點進行分類（圖9），主要包括蛋白質修飾酶、代謝物相互轉化酶、細胞間信號分子、跨膜信號受體、基因特異性轉錄調節因子、蛋白質結合活性調節劑等。運用Matescape 數據庫對127 個潛在靶點進行GO 功能富集分析，閾值P 設定為＜0.05，包括了466 條生物過程、55 條細胞組分、107 條分子功能。生物過程（biological process，BP）（圖10）分析可以看出這些靶點主要涉及對RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、轉錄的正調控、基因表達的正調控、凋亡過程的負調控、細胞增殖的正調控、凋亡過程等466 條生物過程。

圖9 潛在靶點分類

圖10 BP 分析結果（前20 條）

5 KEGG 通路富集分析

運用Matescape 數據庫進對127 個潛在靶點進行KEGG 通路富集分析，閾值P設定為＜0.05，得到169 條KEGG 富集結果，包括PI3K-Akt 信號通路、Hepatitis B 信號通路、MAPK 信號通路等通路等，列出相關富集結果的前20 位（表2）。繪制KEGG 靶點-通路圖（圖11），并對KEGG 通路進行分類（圖12），主要包括人類疾病、信息處理過程、細胞過程和組織系統，多與炎癥通路和病毒感染通路相關。

圖11 KEGG 靶點-通路圖

圖12 KEGG 通路分類圖

表2 KEGG 通路富集分析（前20 條）

6 分子對接分析

將1 中的主要成分包括槲皮素、毛蕊異黃酮、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、芒柄花黃素作為分子對接的配體，將存3 中的核心靶點作為受體，準備相關文件，采用AutoDock Vina 進行分子對接，同時評定自由結合能（圖13-圖14）。若自由結合能＜0，表明配體和受體可以自發地結合，若自由結合能≤-5.0 kcal/mol，則說明兩者結合較好，若結合能≤-7.0 kcal/mol，則說明兩者結合較強[9]。本研究選取≤-7.0 kcal/mol的對接結果，使用PyMol、LigPlot+軟件，將結合能前6位的對接結果制作2D 對接示意圖（圖15）。由圖13可知，所有的自由結合能均≤-5.0 kcal/mol，由圖14可見，自由結合能≤-7.0 kcal/mol 占比63%，說明槲皮素、毛蕊異黃酮、木犀草素、山柰酚、丹參酮IIA、芒柄花黃素與核心靶點均能自發結合，且有較好的結合活性，且大部分均具有較強的結合活性。

圖13 自由結合能評分

圖14 自由結合能比例圖

圖15 分子對接2D 模型圖

討 論

CHB 是世界醫學界公認的難題，具有傳染性，尚不能完全治愈，容易發展成肝硬化、肝癌。目前主要以抗病毒治療為主，但長期單一使用抗病毒藥物容易產生不良反應。越來越多的臨床研究表明，中醫藥在改善慢乙肝患者臨床癥狀、保肝降酶、抗肝臟纖維化、調節免疫等方面具有獨特優勢[10]。赤茵合劑由茵陳蒿湯化裁而來，其組成包括赤芍、茵陳、丹參、葛根、苦參、大黃、生甘草7 味中藥，其中赤芍、茵陳同入肝經，共為君藥，清肝膽之濕，泄血分郁熱；丹參、葛根為臣藥，以宣暢氣機，通絡活血，佐以苦參、大黃，燥濕解毒，通腑散瘀；以甘草為使，淸熱解毒、調和諸藥。諸藥合用，共奏清熱利濕、解毒保肝之效。

本研究采用網絡藥理學研究方法分析預測赤茵合劑治療CHB 的作用機制，通過篩選共預測出赤茵合劑中治療CHB 的有效成分152 個，潛在作用靶點127個。“赤茵合劑-有效成分-靶點-CHB”網絡圖分析得知槲皮素、丹參酮IIA、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、和山柰酚、木犀草素等能連接到較多的靶點，可能是赤茵合劑治療CHB 的關鍵有效成分。槲皮素是茵陳、苦參和甘草的共有成分，有研究發現槲皮素可以減少乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）和乙肝e 抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）的分泌，降低HBV 基因組DNA 的水平，進一步探究發現槲皮素對HBV 的復制也有抑制作用，具有保護肝臟的作用[11-12]。有研究表明芒柄花黃素可以顯著抑制肝癌細胞中COX-2 和cyclin D1 的表達，將細胞阻滯在G0/G1 期，抑制肝癌的發生[13]。山柰酚則可通過下調IL-6 與TNF-α 的水平，減輕肝臟炎癥反應損傷[14]。丹參酮IIA 可將細胞阻滯在G0/G1 期，誘導細胞凋亡。研究表明丹參酮IIA 可以抑制多種人類癌癥的增殖，包括肝細胞癌[15]。木犀草素可降低HBsAg、HBeAg、HBV DNA 復制中間體水平，以及HBsAg 和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg） 的表達[16]，能夠抑制肝星狀細胞HSCs 的遷移，拮抗肝臟纖維化[17]。結果顯示，赤茵合劑可能通過抗炎、抑制HBV 復制、抗纖維化等多途徑實現治療CHB 的目標[18]。

通過PPI 網絡分析得到TP53、AKT1、PTGS2、TNF、IL6、JUN、STAT3、1L1B 等核心靶點，可能是赤茵合劑治療CHB 的核心靶點。TP53 能誘導細胞周期阻滯、凋亡和衰老，進而抑制腫瘤的發展[19]。TP53 是人類癌癥中最常發生突變的基因之一[20]，當TP53 發生突變時，會導致細胞增殖異常，從而促進癌癥發生[21]。AKT1 是人類腫瘤中重要的調節因子，慢病毒介導Akt1 shRNA 載體可抑制肝癌HepG2 細胞增殖和侵襲，并促進其凋亡，進而抑制肝癌的發生發展[22]。PTGS2，又名COX-2，相關研究[23-24]已經證明，COX-2 通過抑制凋亡和誘導增殖促進肝癌細胞系的生長。c-Jun通過細胞自主方式調節肝臟骨橋蛋白（Opn）表達，在HBV 相關腫瘤發生過程中通過促進肝細胞增殖和不典型增生的進展發揮重要作用[25]。STAT3 作為一種轉錄激活因子，經磷酸化激活后可誘導細胞中癌基因的異常表達，進而促進腫瘤的發生發展[26]。HBV 通過下調miR-340-5p 表達，誘導STAT3 過表達，促進肝癌細胞遷移[27]。IL-1B 是一種促炎細胞因子，通過氧化應激抑制HBV 復制發揮抗病毒作用[28]。TNF-α是參與HBV 感染免疫應答的最重要的細胞因子之一[29]，被認為是HBV 感染的關鍵因素，可促進免疫介導的病毒學控制[30]，抑制HBV 在肝臟中的表達和復制，從而誘導清除HBV[31]。IL6 是動態免疫調節網絡的重要組成部分，可與IL8 共同促進炎癥細胞釋放炎癥介質，參與乙型肝炎的炎癥反應，使吞噬細胞吞噬游離的乙肝病毒和乙肝病毒感染的細胞[32]。

KEGG 富集結果顯示，顯示赤茵合劑的成分可作用于Hepatitis B 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等，這表明赤茵合劑可能通過免疫細胞分化和調控免疫應答參與調控CHB 進程。Hepatitis B 通路是其中一種顯著富集的信號通路，通過調控下游的AKt 蛋白，作用于PI3KAkt 通路，進而調控下游的轉錄因子TP53，再作用于TP53 信號通路的caspase3 蛋白，進而阻斷TGFβ 誘導的干細胞凋亡，達到抑制肝癌的進展的目的[33]。Hepatitis B 信號通路通過調控下游的HBx 蛋白，可激活MAPK 細胞信號轉導系統，發揮抑制腫瘤抑制蛋白p53 的作用，同時具備抑制細胞凋亡和前凋亡的功能[34]。結果表明，赤茵合劑藥物成分可能通過調控乙型肝炎通路中多種蛋白的表達，參與肝細胞增殖、侵襲、轉移等過程，從而減緩HBV 病程的進展[35]。絕大多數病毒都會通過調控PI3K-Akt 信號通路，調節病毒在早期感染的活力[36]。研究表明，MAPK 信號通路參與炎癥反應、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤侵襲等多種生物學過程[37]。綜合分子對接結果分析，丹參酮IIA、槲皮素、木犀草素可能為赤茵合劑治療CHB 的關鍵核心成分，PTGS2、JUN、STAT3、1L1B 可能為赤茵合劑治療CHB 的關鍵核心靶點。

綜上，通過網絡藥理學方法和分子對接技術，預測出赤茵合劑治療CHB 的主要有效成分包括丹參酮IIA、槲皮素、木犀草素等，可能通過參與RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、轉錄的正調控、基因表達的正調控、凋亡過程的負調控、細胞增殖的正調控等發揮治療CHB 的作用，其機制可能與Hepatitis B、PI3KAkt、MAPK、TNF 等相關炎癥信號通路和病毒感染信號通路相關，有助于從新的角度挖掘赤茵合劑治療CHB 的潛在價值，為后續進一步的生物實驗研究與臨床應用提供了一定的理論基礎。

本研究以網絡藥理學方法預測的潛在有效成分是由藥物有效成分和疾病靶點對比映射后所得，隨著有效成分的篩選條件及所研究疾病的改變，可能導致中藥復方中公認的有效成分未入選。且中藥方劑以中醫藥理論的配伍為基礎，各中藥協同發揮治療作用，機制復雜，并不是將單獨的中藥材分解成已知化學成分簡單的加和，未入選的有效成分作用也不可忽略。研究發現，許多生物利用度低的中藥成分在腸道聚集的濃度高于血藥濃度，由于腸道菌群的穩態調節，這些中藥才能夠發揮良好的療效。對于那些生物利用度低及血藥濃度低的中藥來說，只以OB 和DL作為篩選，考慮欠全面，且忽視了成分含量對藥效影響和成分之間的相互作用。鑒于以上所述網絡藥理學的局限性，赤茵合劑治療CHB 的作用機制是否與網絡藥理學預測的結果一致，將來需要進一步的生物實驗來驗證預測結果的可靠性和準確性。