“陳皮-半夏”治療穩定型心絞痛的作用機制研究*

謝博歡，李雁，常艷賓，林騰龍，李琳琳

黑龍江省中醫藥科學院 黑龍江哈爾濱 150036

穩定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）又可稱勞力性心絞痛，是慢性冠狀動脈綜合征 （chronic coronary syndrome，CCS）中的較為常見的疾病。隨著SAP 患病率以及病死率的逐年升高，近年來SAP被WTO 認為是心血管疾病中最常見的威脅人類健康的主要死因[1]。臨床常用藥為：β 受體拮抗劑、ACEI/ARB 類、硝酸酯制劑、抗血小板藥、鈣通道阻滯劑、降脂藥等藥物，雖然治療效果不錯，但是服用這些藥物有可能會出現某些不良反應導致患者停藥，又或長期服用會導致機體產生耐藥性，此外還有患者依從性差等其他原因，進而會影響整體的治療效果。而在祖國醫學領域中，隨著對SAP 認識的逐漸加深，中醫藥不僅具備療效好、安全性高、不良反應發生率低這些優點，而且還同時具有延緩病情發展、降低疾病復發率、改善預后等其他方面的獨特優勢，擁有非常廣闊的研究前景。

陳皮、半夏作為臨床常用藥，兩者常相須為用，而且通常作為治療心血管疾病的核心藥對被廣泛使用，用來治療較為常見的痰濁阻滯型SAP[2]。網絡藥理學構建藥物的“活性成分-靶標-通路-疾病”網絡，是建立在生物信息學、系統生物學、藥理學等多個學科的技術和知識的基礎之上，可以幫助我們更加得清楚藥認識藥物疾病之間的關系，了解藥物作用于疾病的機制，是一種可以全面、系統得進行科學研究的方法，為中醫藥的進一步研究提供了新方法、新角度，為廣大學者所喜愛。本研究借助網絡藥理學，研究藥對“陳皮-半夏”治療SAP 的作用機制，從而為其治療SAP 的藥理學研究及臨床應用提供進一步參考。

資料與方法

1 “陳皮-半夏”中活性成分的篩選和靶點預測

在TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）網絡平臺分別以陳皮、半夏作為關鍵詞檢索、獲取其活性成分，并篩選活性成分，篩選的條件設置為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥ 0.18，篩選得到活性成分后選擇“R elated Targeted”，進一步檢索篩選出來的活性成分，得到藥物活性成分的相關靶點，再利用Uniport（https：//www.uniprot.org/）統一整合成Gene ID。

2 構建“陳皮-半夏”“活性成分-靶點”網絡圖

將陳皮、半夏得活性成分以及靶點導入CytoScape 3.8.0 構建出網絡圖，在構建出的網絡中藥物活性成分、活性成分的靶點基因用“節點”（node）表示，二者之間的關系用“邊”（edge）表示；使用CytoScape 內置的Network Analyzer 工具分析這個網絡圖特征，包括網絡連接度（degree）、介度（betweenness）和緊密度（closeness）等數據，以此研究藥物的活性成分與靶點基因及兩者之間的關系。

3 穩定型心絞痛相關靶點檢索

將“stable angina pectoris”作為關鍵詞，在Gene cards（https：//www.genecards.org）、Drug bank（https：//go.drugbank.com/）、OMIM（http：//www.omim.org）、OMIM-Gene Map（http：//wwwomim.org/search/advanced/geneMap）等疾病基因數據庫檢索、篩選，整理得出的結果，之后在Uniprot 數據庫中將結果進行統一規范，并借助VENNY2.1 獲得藥物與疾病的交集靶點基因（靶點蛋白）。

4 蛋白質互作網絡及模塊構建

使用String（https：//cn.string-db.org/）構建蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡。將“陳皮-半夏”與SAP 的交集靶點分別導入String 內，生成PPI 網絡，導出結果，利用CytoScape3.8.0，繪制高級PPI 網絡圖。運用CytoScape 中的MCODE 插件，通過分子復合物檢測算法對相互作用關系進行分析，構建不同功能模塊。

5 通路富集分析

將交集靶點導入Metascape 網絡平臺（https：//metascape.org） 進 行GO-BP（biological process）、GO-CC（cellular component）、GO-MF（molecular function）KEGG 分析，保存分析結果并通過微生信網站進行可視化。

6 “藥物成分-疾病靶點-通路”網絡構建及分析

借助CytoScape3.8.0 來構建“藥物成分-疾病靶點-通路”網絡圖，圖中“節點”代表活性成分、通路，“邊”代表二者之間的作用關系；使用CytoScape 中的Network Analyzer 分析網絡特征，包括連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（closeness）等，以研究活性成分、通路及靶點基因及其相互之間的關系。

結 果

1 “陳皮-半夏”活性成分、靶點的獲取

在TCMSP 數據庫初步獲取成分陳皮63 個，半夏116 個，通過OB 和DL 參數篩選后，獲得活性成分陳皮5 個，半夏13 個，共18 個見表1。選擇Related Targets 預測陳皮、半夏篩選出的活性成分的靶點，并利用Uniport 轉換成gene ID，獲得陳皮活性成分靶點基因66 個，半夏活性成分的靶點基因136，共獲得202 個靶點基因。

表1 “陳皮-半夏”活性成分

2 “陳皮-半夏”活性成分-靶點網絡構建和分析

將陳皮、半夏的活性成分以及其相應的靶點基因導入CytoScape3.8.0 繪制其關系網絡圖并分析，共獲得106 個節點與219 條關系，結果見圖1（節點表示活性成分、靶點基因，連線表示作用關系，節點大小、節點顏色深淺和節點透明度均按degree 值從大到小依次排列，即degree 值越大，節點越大、顏色越深，透明度越高）。

圖1 “陳皮-半夏”活性成分-靶點網絡

3 SAP 相關靶點檢索檢索

利用Gene cards、Drug bank 、OMIM、OMIM-Gene Map 等疾病數據庫搜索“stable angina pectoris”，得到的靶點個數分別為854、119、101、8，篩選并去除重復值后得到靶點1016 個。利用VENNY2.1 繪制韋恩圖可得出藥物靶點與疾病靶點交集為48 個，見圖2（list1為疾病靶點基因，list2 為藥物靶點基因）。

圖2 韋恩圖

4 “陳皮-半夏”治療SAP 的PPI 網絡構建

4.1 “陳皮-半夏”治療SAP 的PPI 網絡圖繪制 運用String 構建“陳皮-半夏”與SAP 共同靶點的PPI網絡，將交集靶點基因提交至String 網絡平臺，得到PPI 網絡，剔除掉游離基因后如圖3A，保存結果將其導入CytoScape3.8.0，繪制高級PPI 網絡圖，見圖3B。

圖3 A PPI 網絡

圖3 B CytoScape 美化后的PPI

PPI 網絡圖之所以是無向圖，是因為網絡中的蛋白質是相互作用的。community 或module 是PPI 中隱藏的子網，是網絡中密度較高的區域，是具有生物學意義的合集，可表示蛋白質復合體（protein complex）或者功能模塊（functional module）[3]。故為更精確地分析“陳皮-半夏”治療SAP 的作用機制，在構建出PPI 網絡后運用CytoScape3.8.0 中的MCODE 工具，通過其特有算法對活性成分與靶點得相互作用關系進行分析，構建出module1、module2、module3 三個功能模塊，見圖4A、4B、4C。根據P 值，分別保留Module中3 個最佳評分的生物學進程對其進行功能描述，見表2。

圖4 A Module1

圖4 B Module2

圖4 C Module3

表2 Module1、2、3 最佳生物進程

5 “陳皮-半夏”治療SAP 通路富集分析可視化

將48 個交集基因導入Metascape 網絡平臺進行富集分析，分別進行KEGG 以及GO 的BP、CC、MF 富集分析，保存結果，并運用微生信網站將結果中Log10（P）值排名為前20 的繪制氣泡圖進行可視化，KEGG的可視化結果見圖5，GO-BP、CC、MF 的可視化結果見圖6（氣泡面積大小代表通路中的基因數多少，氣泡的顏色由綠到紅代表-Log10（P）值從小到大，橫軸代表P 值，豎軸代表通路名稱）

圖5 KEGG 富集分析

圖6 GO 富集分析-BC、CC、MF

6 “藥物成分-SAP 靶點-通路”網絡圖構建及關鍵成分及靶點基因篩選

排除與本病無關的通路后，使用CytoScape 軟件制作“藥物成分-疾病靶點-通路”網絡圖，見圖7（藥物成分用菱形表示，通路用倒三角表示，疾病靶點用圓形表示，作用關系用連線表示，degree 值大小用節點面積大小代表）。并通過CytoScape 內置的Network Analyzer 分析其網絡拓撲學參數，分析表明，β-谷甾 醇（Degree）為32，介 度（Betweenness Centrality）為0.2557，緊密度（Closeness Centrality）為0.4474，預測β-谷甾醇為“陳皮-半夏”藥對治療SAP 的關鍵成分，其次為Cavidine（連接度為27，介度為0.1861，緊密度為0.4182）、川陳皮素（連接度為25，介度為0.2090，緊密度為0.4212），見表3。PTGS2 在網絡中的連接度為14，介度為0.1441，緊密度為0.4978，預測PTGS2 為“陳皮-半夏”藥對治療SAP 的最主要靶點。HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 亦為相對重要的靶點。

圖7 “藥物成分-疾病靶點-通路”網絡圖

表3 “陳皮-半夏”治療SAP 的關鍵靶點網絡節點特征參數

討 論

穩定型心絞痛（SAP）在祖國醫學中學中歸為“胸痹”“心痛”病的范疇，引起疾病發生的內外因素包括：情志失調、飲食不節、勞倦內傷、寒邪內侵、體虛等，其病位在心、肝、腎、脾等臟腑，主要在心，基本病機為“陽微陰弦”，為本虛標實之證，本虛為氣、血、陰、陽虧虛以致心脈失養；標實為寒凝、血瘀、氣滯、痰濁導致胸陽不展、心脈不通[4]。由于現在人們飲食上膏粱厚味，導致痰濁內生，阻滯氣機，所以臨床中痰濁阻滯型SAP 較為常見，“陳皮-半夏”在臨床中是常用的理氣祛痰藥對，陳皮味苦、辛，性溫，燥濕化痰、理氣開胸，半夏味辛，性溫，溫化寒痰，尤善治臟腑之痰，兩者相須為用，可理氣化痰，通痹止痛[5]，有效治療“痰濁阻滯型”SAP。

本研究通過網絡藥理學初步篩查“陳皮-半夏”的主要活性成分為naringenin（柚皮素）、nobiletin（川陳 皮 素）、coniferin（松 柏 苷）、baicalein（黃 芩 素）、beta-sitosterol（β- 谷 甾 醇）、Baicalin（黃 芩 苷）、Stigmasterol（豆甾醇）等18 個活性成分，篩選出與SAP 相 關 的 靶 點 基 因MAPK3、TP53、HSP90AA1、PPARG、JUN 等48 個。PPI 可 分 解 出 三 個 功 能 模塊，三個模塊中最佳評分的生物學進程為：Cellular response to chemical stress、Positive regulation of heart rate by epinephrine-norepinephrine、Blood coagulation，fibrin clot formation。GO 富集分析集中作用于regulation of tube diameter（管徑調節）、blood vessel diameter maintenance（血 管 直 徑 維 持）、regulation of tube size（管 尺 寸 調 節）、regulation of muscle contraction（調 節 肌 肉 收 縮）、regulation of blood pressure（調節血壓）、regulation of blood circulation（調節血液循環）、adenylate cyclase-modulating G proteincoupled receptor signaling pathway（腺苷酸環化酶調節G 蛋白偶聯受體信號通路）、regulation of muscle system process（肌肉系統過程）、vascular process in circulatory system（循環系統中的血管進程）、blood circulation（血液循環）等相關生物過程（biological process），KEGG 功能富集集中于Adrenergic signaling in cardiomyocytes（心肌細胞中的腎上腺素能信號）、Calcium signaling pathway（鈣信號通路）、Lipid and atherosclerosis（脂質和動脈粥樣硬化）、cAMP signaling pathway（cAMP 信號通路）、Apoptosis（細胞凋亡）等信號通路。這證明“陳皮-半夏”治療“痰濁阻滯型”SAP 具有多成分、多靶點、多通路聯合生效的優點。

將“藥 物 成 分-SAP 靶 點- 通 路”網 絡 用CytoScape 內置的Network Analyzer 分析其網絡拓撲學參數可以得出：β-谷甾醇、Cavidine、川陳皮素為“陳皮- 半夏”治療SAP 的關鍵活性成分；PTGS2、HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 為為“陳皮-半夏”治療SAP 的關鍵靶點基因。

有實驗[6]發現，Nob（川陳皮素）可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路抑制高糖誘導的心肌細胞肥大，減輕氧化應激損傷。也有實驗[7]發現β-谷甾醇可防止中風、靜脈血栓等危險事件的發生，是β-谷甾醇經過非競爭性抑制凝血酶的活性從而發揮抗凝作用，使血栓溶解。此外還有實驗[8]得出，β-谷甾醇對哇巴因、烏頭堿以及心肌缺血引起的心率失常有明顯遏制作用。因此“陳皮-半夏”可能通過川陳皮素、β-谷甾醇治療SAP。

有研究[9]報道，COX-2（PTGS2）靶點蛋白在炎癥和動脈血栓形成中發揮關鍵作用，血小板聚集和局部炎癥反應都是加快血栓形成的重要因素，下調COX-2 的表達能夠改善可能引起血栓的細胞炎性因子變化，降低細胞炎性反應，有可能減緩冠心病動脈血栓形成。在急性心梗和冠心病患者中血清COX-2水平升高，在大鼠頸動脈血栓形成模型中COX-2 的表達在誘導血栓形成后14 天顯著升高，而下調COX-2后能顯著改善大鼠的癥狀[10]。

李琳、蔡紅雁、郭濤[11]等做實驗證明，心功能異常、心肌肥大和心臟重塑可由β 腎上腺素能受體信號（βA R）的長期激活引起。王彥珍、羅健東[12]發現當外界刺激或體液因子導致細胞內Ca2＋濃度升高時，通過Ca2＋／CaM 激活鈣信號通路（CaN），活化的CaN 發生細胞質中的NF-AT3 去磷酸化進入細胞核等一系列反應，結果使心肌收縮蛋白基因表達上調、蛋白合成增加、細胞體積增大，心肌從而發生肥大。過表達circUK2 可通過靶向下調miR-483-5p 抑制oxLDL 誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡，從而減少心血管內皮細胞損傷[13]。因此推測“陳皮-半夏”治療SAP 主要是通過β-谷甾醇、川陳皮素作用于PTGS2（COX-2）靶點蛋白刺激心肌細胞中的腎上腺素能信號、鈣信號通路、細胞凋亡等信號通路來治療SAP。

結合上述討論可以看出，“陳皮-半夏”這一藥對的同一活性成分可作用于不同靶點，而同一靶點又可調控不同生物學過程和信號通路，顯現出“陳皮-半夏”治療SAP 擁有多通路、多靶點聯合作用的優點。這表明如果調控網絡中的單個或多個重要靶點即可對整個網絡進行調節，這為臨床上使用“陳皮-半夏”治療“痰濁阻滯”型SAP 提供了科學依據，為后續審定“陳皮-半夏”臨床療效指標提供了標準，也為發掘“陳皮-半夏”的潛在作用機制提供了新的方向。網絡藥理學運用網絡科學的方法來研究中藥多方面的藥理特性，用網絡拓撲性質來反饋中藥有效成分的各項理化和生物學性質，為探索單味中藥、中藥藥對、中藥方劑的各種復雜作用模式提供了新的角度[14]，同時也為其在臨床中的應用提供了一定的科學依據，但由于只是推論，所以仍舊需要實驗來加以驗證，進而明確“陳皮-半夏”治療SAP 的主要調控靶點。