刺山柑對類風濕關節炎大鼠滑膜組織自噬相關蛋白表達的影響

丁霞　昂沙爾?畢哈孜　霍新慧

摘要 目的：觀察刺山柑果風濕止痛貼對類風濕關節炎大鼠滑膜組織自噬相關蛋白表達的影響，并探究刺山柑治療類風濕關節炎（RA）的可能作用機制。方法：將40只無特定病原體（SPF）級SD大鼠采用隨機數字法分為正常組，模型組，陽性藥組和刺山柑組，每組10只，對造模的大鼠在足跖底部注射0.1 mL完全弗氏佐劑。模型組、陽性藥組和刺山柑組分別于大鼠左后足跖部外敷空白凝膠、傷濕止痛膏以及刺山柑果風濕止痛貼，每組持續干預21 d。觀測關節炎（AI）指數和足爪容積的指標，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，蛋白質印跡法檢測滑膜組織中微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、Beclin蛋白復合物-1（Beclin-1）蛋白表達。結果：與正常組比較，模型組和陽性藥組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達均上升（P<0.05，P<0.01），刺山柑組LC3-Ⅱ蛋白表達降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表達升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達差異無統計學意義，刺山柑組LC3-Ⅱ蛋白表達降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表達升高（P<0.01）。結論：刺山柑果風濕止痛貼治療AA大鼠比傷濕止痛膏療效更加顯著，從而為刺山柑治療RA提供一定的科學依據，其相關機制可能與蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表達有關。

關鍵詞 類風濕關節炎；刺山柑；佐劑性關節炎大鼠；自噬；腫瘤壞死因子-α；蛋白表達；微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ；Beclin蛋白復合物-1

Effect of Capparis spinosa on the Expression of Autophagy-related Proteins in Synovial Tissues of Rats with Rheumatoid Arthritis

DING Xia，Angshaer Bihazi，HUO Xinhui

（College of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Capparis spinosa fruit paste on the expression of autophagy-related proteins in synovial tissues of rats with rheumatoid arthritis，and to explore the possible mechanism of C.spinose in RA.Methods：Forty SPF rats were randomly divided into a normal group，a model group，a positive drug group，and a C.spinose group，with 10 rats in each group.The rats to be modeled were injected with 0.1 mL complete Freund′s adjuvant at the foot bottom.The model group，positive drug group，and C.spinose group externally applied blank gel，Shangshi Zhitong Ointment，and C.spinosa fruit paste，respectively，on the left posterior plantar of rats for 21 d.Arthritis index（AI） and paw volume index were measured.The level of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α） was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and the protein expression of microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ（LC3-Ⅱ） and Beclin-1 in synovial tissues was detected by Western blot.Results：As compared with the normal group，the protein expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in the model group and positive drug group was increased（P<0.05，P<0.01），and that of LC3-Ⅱ was decreased（P<0.01） while Beclin-1 was increased（P<0.01） in the C.spinose group.As compared with the model group，the protein expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ in the positive drug group had no significant difference，while that of LC3-Ⅱ was decreased（P<0.01） and Beclin-1 protein was increased（P<0.01） in the C.spinose group.Conclusion：C.spinosa fruit paste is more effective in the treatment of rats with RA than Shangshi Zhitong Ointment，thus providing a scientific basis for the treatment of RA by C.spinosa，and the related mechanism may be related to the expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1.

Keywords Rheumatoid arthritis; Capparis spinosa; Rats with adjuvant arthritis; Autophagy; Tumor necrosis factor-α; Protein expression; microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）; Beclin-1

中圖分類號：R245.81；R29文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.02.006

類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種不可治愈的自身免疫疾病，以關節、骨發生炎癥為主要特征，其癥狀通常為關節疼痛、腫脹，甚至身體功能會被嚴重損害［1］。自噬（Autophagy）是細胞回收細胞質成分產生能量的降解機制［3］。研究發現，自噬是RA發病的相關機制之一，自噬可能參與了RA滑膜成纖維細胞對凋亡誘導的抵抗，其與破骨細胞生成有關［4］。刺山柑（Capparis Spinosa L）作為經典的新疆地方藥材在臨床和民間用來治療風濕及RA已有悠久的歷史［5］。刺山柑主要生長于荒漠戈壁之中，在我國主要產于西北干旱地區，新疆的沙漠地區分布最為廣泛，其用藥部位大多為果實和根皮，分布于世界各個國家［6］。本實驗用刺山柑果風濕止痛貼治療佐劑型關節炎（Adjuvant Arthritis，AA）大鼠，觀察其對RA自噬相關蛋白微管相關蛋白輕鏈-3-Ⅱ（Microtubule-associated Protein Light Chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、Beclin蛋白復合物-1（Beclin-1）的影響，探討細胞自噬與RA發病機制的關聯，為該藥治療RA的提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取40只無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級8周齡維斯塔爾（Wistar）大鼠購買并飼養在新疆醫科大學動物實驗中心，雌雄各半，體質量160～200 g，實驗動物生產許可證號：SYXK（新）2016-0002；動物房濕度和溫度分別控制在55%～60%和20～24 ℃左右，大鼠隨意飲食和進水；12 h光照，晝夜循環。該研究通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審批（倫理審批號：20180223-136）。

1.1.2 藥物 刺山柑果風濕止痛貼（新疆醫科大學中醫學院中藥系提供，批號：20161022）；傷濕止痛膏（黃石市力康藥業有限公司，批號：20170100）。

1.1.3 試劑及儀器 完全弗氏佐劑（Complete Freund′s Adjuvant，CFA）（Sigma公司，美國，批號：SLBW7430）；腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）的試劑盒（Cusabio公司，美國，批號：G22018349）；LC3-Ⅱ試劑盒（Abcam公司，英國，批號：GR3201455-1）；Beclin-1試劑盒（Abcam公司，英國，批號：GR3204186-1）；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，Abcam公司，英國，批號：GR3249122-1）；多功能酶標儀（TECAN公司，瑞士，型號：Infinite M200 Pro）；通用型電泳儀（BIO-RAD Serial公司，美國，型號：042BR11250）；電泳槽（BIO-RAD Serial公司，美國，型號：552BR071035）；轉印槽（BIO-RAD Serial公司，美國，型號：49BＲ36704）；微型離心機（六一儀器廠，型號：WD-2105A）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只大鼠適應性飼養3 d后，按編號采用隨機數字法分為10只正常組和30只進行模型制備。用75%乙醇于大鼠左后足跖內消毒并皮內注射完全弗氏佐劑0.1 mL/只致炎，建立AA大鼠模型。造模3 d后大鼠左足趾腫脹度根據關節炎指數（Arthritis Index，AI）積分法評定［7］：無關節紅腫計0分；足趾關節紅腫計1分；趾關節和足趾腫脹計2分；踝關節以下紅腫計3分；全部足爪（包括踝關節在內）腫脹計4分。AI值即每只大鼠四肢評分分數之和。評分達到6分以上即為造模成功。將30只模型大鼠按隨機數字表分為3組：模型組、陽性藥組、刺山柑組。

1.2.2 干預方法 依照本課題組前期經驗［8］，在成功造模后4 h，刺山柑組給予左后足跖以刺山柑果風濕止痛貼［30 cm2/（kg·d）］經皮給藥；陽性藥組和模型組給予同樣部位和方式分別以傷濕止痛膏［15 cm2/（kg·d）］、空白凝膠給藥，4 h/次，1次/d，連續給藥21 d?？瞻捉M正常飼養，無任何干預。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 一般狀態 每天對大鼠的體質量、精神狀態、活動情況、飲食以及飲水量、大小便等一般情況進行觀察并做好相應記錄。

1.2.3.2 AI指數 各組大鼠按照1.2.2操作方法于造模成功和治療結束后進行AI評分。

1.2.3.3 足爪容積 于造模后和各個療程之后結束后測量足爪容積，在AA大鼠同一定位做浸水標記線，用排水法原理測量足爪容積，每只足爪測量2次取平均值。

1.2.3.4 酶聯免疫吸附試驗法檢測大鼠血清TNF-α水平 大鼠治療21 d后統一處理，將各組大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉后，腹主動脈采血并做相應記號，并放置于室內1 h后離心。離心半徑10 cm，以17 000 r/min轉速，在4 ℃環境中，離心10 min，取上清液放入EP管內然后-20 ℃保存。嚴格按照試劑盒說明書逐步操作。

1.2.3.5 蛋白質印跡法檢測大鼠滑膜自噬相關蛋白的表達水平 將處死后的大鼠的踝關節剝離并放入4%多聚甲醛固定液中保存?；そM織常規病理切片，脫蠟至水，按照蛋白質印跡法檢測大鼠滑膜組織LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達量，內參為GAPDH。取大鼠滑膜組織用冰研磨，然后離心分離取上清液，蛋白量的測定使用二喹啉甲酸（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白質試劑盒；依次加樣、凝膠電泳、轉膜和室溫封閉；按抗體說明書加入一抗LC3-Ⅱ（1∶3 000）、Beclin-1（1∶3 000）、置4 ℃冰箱過夜，洗膜，再加入二抗（1∶10 000），增強化學發光法（Enhanced Chemiluminescence，ECl）顯色;放于凝膠圖像成像分析系統，曝光其蛋白條帶。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間方差齊性用最小顯著差異法（LSD），方差不齊性用Dunnett T3檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況的影響 模型制備成功AA大鼠每日無精打采、食欲不振、體質量下降，足部出現明顯紅腫，左后肢足跖部最嚴重，同時也伴有部分四肢輕微紅腫。陽性藥組和刺山柑組大鼠經治療后精神和活動度等均有明顯改善，食量和體質量均有增長。

2.2 AI和足爪容積的變化 與正常組比較，其余3組大鼠造模后，其AI和足爪容積指標均明顯上升（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和刺山柑組大鼠經治療后，其AI和足爪容積指標均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.3 各組血清TNF-α水平的變化 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α水平明顯上升（P<0.05）。與模型組比較，陽性藥組和刺山柑組TNF-α水平均顯著下降（均P<0.05）。見表2。

2.4 滑膜組織LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達的變化 與正常組比較，模型組和陽性藥組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達均升高（P<0.05，P<0.01），刺山柑組LC3-Ⅱ蛋白表達降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表達升高（P<0.01）；與模型組比較，刺山柑組LC3-Ⅱ蛋白表達降低（P<0.01），Beclin-1蛋白表達升高（P<0.01）。見表3、圖1。

3 討論

中醫學中RA屬“痹證”范疇，通常由于先天稟賦不足，外感邪氣閉阻經絡導致［9］。由于該病發病機制復雜，目前尚沒有能夠完全治愈的療法，中醫針灸治療有其獨特的優勢，能有效地緩解癥狀，控制病程情［10］。刺山柑作為傳統民族藥，在新疆地區治療RA已有悠久的歷史，特別是在抗炎鎮痛方面療效確切［11］。本課題組前期已證實刺山柑果風濕止痛貼具有良好的抗炎止痛作用，其機制可能與基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）表達有關［8］。本實驗進一步從自噬角度觀察刺山柑果風濕止痛貼對AA大鼠滑膜組織自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表達的影響，從而為刺山柑治療RA提供一定的科學依據。

現代醫學發現，RA的發病機制與免疫功能紊亂密切相關，通過相應途徑啟動特意性免疫應答［12］；同時滑膜組織作為關節腔內的膜狀非免疫器官，會分泌更多的炎癥介質，如TNF-α、白細胞介素-17等［13］。TNF-α不僅能阻斷RA的炎癥和骨侵蝕，還能誘導RA滑膜成纖維細胞（RA Svnovial Fibroblasts，RASFs）的自噬［14］。RASFs能改變侵襲性和侵襲性表型的信號通路表達，持續性刺激自噬通路，使細胞死亡［15］，造成RASFs增殖和活化，從而導致RA患者關節的慢性炎癥和關節破壞［16］。

CFA誘導的AA大鼠模型是最常用的RA模型［17］。AA大鼠模型造模簡便、實用性強，主要表現為早期被干預部位的炎癥反應，造模成功的大鼠癥狀和病理改變與RA患者極其相似，所以現已成為研究RA理想模型［18］。

自噬是細胞內的一種“自食”現象，細胞通過降解不必要和功能障礙的自身成分來對損傷做出反應［19］，但這種能力可能會導致細胞死亡，所以，細胞自噬具有雙重作用［15］。在哺乳動物細胞中，自噬可分為3種類型，雖然每一種在形態上是不同的，但三者最終都將貨物輸送到溶酶體進行降解和回收［20］。自噬在免疫系統中具有清除細胞內病原體、分泌途徑、促進淋巴細胞發育、促炎信號轉導等功能［21］。自噬蛋白是自噬的核心分子，在免疫細胞的分化和維持內環境穩態等免疫過程中發揮作用［22］。LC3和Beclin-1是重要的自噬相關蛋白［23］。

LC3是酵母自噬相關蛋白（Autophagy-related，Atg）8的哺乳動物同源物，存在于自噬溶酶體的降解過程中，被用作監測自噬的特異性標記［24］。誘導自噬后，LC3與磷脂酰乙醇胺結合，并靶向自噬膜，因此，LC3定位的改變被用來衡量自噬［25］。LC3被半胱氨酸蛋白酶Atg4切割，產生細胞溶質形式的LC3-I，在被Atg7激活后，被轉移到Atg3，以改變與磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethnolamine，PE）的綴合形式，命名為LC3-Ⅱ［26］。LC3-Ⅱ是測試自噬活性最常用的標記，是成熟過程中唯一與自噬體穩定相關的蛋白質［25］。Beclin-1是自噬核心復合物的重要組成部分是自噬啟動的必要因素，是一種多結構域蛋白質，以正向調節和負向調節的方式促進自噬的調節，與Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶復合體1（Class Ⅲ Phosphatidylinositol-3-kinase（PI3KC3）Complex 1，PI3KC3-C1，）形成復合體，調節其他相關聯蛋白表達在自噬前體中的位置，在自噬體的形成過程中舉足輕重［27］。

本實驗AA大鼠經治療后陽性藥組、刺山柑組AI和足爪容積指標均降低；經治療后，刺山柑組LC3-Ⅱ蛋白表達顯著降低，Beclin1蛋白表達顯著升高。

綜上所述，AA大鼠經治療后，陽性藥組和刺山柑組大鼠足趾腫脹均有改善，且刺山柑組消腫效果更明顯。刺山柑果風濕止痛貼治療AA大鼠比較傷濕止痛膏療效更顯著，相關結論與本課題組前期研究結果一致，其相關機制可能與抑制大鼠滑膜組織自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達、上調蛋白Beclin1表達有關，但其具體作用機制還有待進一步研究。

利益沖突聲明：無。

參考文獻

［1］FIRESTEIN GS，MCINNES IB.Immunopathogenesis of Rheumatoid Arthritis［J］.Immunity，2017，46（2）：183-196.

［2］GLICK D，BARTH S，MACLEOD KF.Autophagy：cellular and molecular mechanisms［J］.J Pathol，2010，221（1）：3-12.

［3］VOMERO M，BARBATI C，COLASANTI T，et al.Autophagy and Rheumatoid Arthritis：Current Knowledges and Future Perspectives［J］.Front Immunol，2018，9：1577.

［4］張鈮雪，蘇曉慧，田雅格，等.自噬在類風濕關節炎中的作用及中藥干預研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2021，27（6）：169-175.

［5］高潔，何江，張偉，等.維吾爾藥刺山柑果風濕止痛貼急性和慢性毒性試驗研究［J］.毒理學雜志，2017，31（6）：486-490.

［6］霍新慧，王延蛟，李盼，等.刺山柑果風濕止痛貼對類風濕關節炎大鼠滑膜組織MMP-9表達的影響［J］.上海中醫藥雜志，2020，54（1）：80-83.

［7］龔雪，汪元.類風濕關節炎中醫病因病機研究進展［J］.風濕病與關節炎，2020，9（6）：62-65.

［8］麻信信，朱延濤.中醫藥治療類風濕關節炎研究進展［J］.新中醫，2020，52（19）：21-23.

［9］柳雨亭，孫羽亭，程雪梅，等.刺山柑的化學成分與藥理作用研究進展［J］.世界科學技術-中醫藥現代化，2019，21（12）：2599-2608.

［10］BYUN S，LEE E，LEE KW.Therapeutic Implications of Autophagy Inducers in Immunological Disorders，Infection，and Cancer［J］.Int J Mol Sci，2017，18（9）：28895911.

［11］褚夢瑤，路月亭.腫瘤壞死因子α在自身免疫性疾病中的表達和臨床應用前景［J］.河北醫科大學學報，2020，41（3）：358-362.

［12］王丹，韓曉蕾，郝晟瑜，等.細胞自噬在自身免疫性疾病中的調控作用研究進展［J］.細胞與分子免疫學雜志，2015，31（10）：1429-1432.

［13］陳慧芳，王曉霞，何佳莉，等.腫瘤壞死因子α與白細胞介素6和白細胞介素10及相關信號通路在類風濕關節炎合并抑郁癥中的研究進展［J］.中國醫藥，2019，14（，4）：629-632.

［14］NETEA-MAIER RT，PLANTINGA TS，VAN DE VEERDONK FL，et al.Modulation of inflammation by autophagy：Consequences for human disease［J］.Autophagy，2016，12（2）：245-260.

［15］范紫微，古虹，鄒天琪，等.五味子木脂素對佐劑性關節炎大鼠的抗炎作用及對自噬相關通路的影響［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2020，34（6）：442-450.

［16］尤君怡，龔正豐，梁國強.吳門芪藤湯對佐劑性關節炎大鼠膝骨關節滑膜、軟骨組織細胞凋亡的影響［J］.河北中醫，2019，41（2）：262-267，274，封3.

［17］WANG X，GUO Z，DING Z，et al.Inflammation，Autophagy，and Apoptosis After Myocardial Infarction［J］.J Am Heart Assoc，2018，7（9）：1959.

［18］陳進寶，徐可，邱艷艷，等.沙蟾毒精誘導人結腸癌細胞凋亡和自噬的體外研究［J］.河北中醫，2020，42（8）：1216-1221，1232，封3.

［19］WU DJ，ADAMOPOULOS IE.Autophagy and autoimmunity［J］.Clin Immunol，2017，176：55-62.

［20］YANG Z，GORONZY JJ，WEYAND CM.Autophagy in autoimmune disease［J］.J Mol Med（Berl），2015，93（7）：707-717.

［21］王堃，黃日龍，吳生兵，等.電針預處理對心肌缺血大鼠心肌自噬相關蛋白LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ、Beclin 1、HIF-1α表達影響［J］.遼寧中醫藥大學學報，2020，22（7）：44-47.

［22］KUMA A，MATSUI M，MIZUSHIMA N.LC3，an autophagosome marker，can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy：caution in the interpretation of LC3 localization［J］.Autophagy，2007，3（4）：323-328.

［23］THEKKINGHAT AA，YADAV KK，RANGARAJAN PN.Apolipoprotein L9 interacts with LC3/GABARAP and is a microtubule-associated protein with a widespread subcellular distribution［J］.Biol Open，2019，8（9）：671065.

［24］WANG J，ZHAO Q.Expression of CCR3，SOX5 and LC3 in patients with elderly onset rheumatoid arthritis and the clinical significance［J］.Exp Ther Med，2017，14（4）：3573-3576.

［25］WECHMAN SL，PRADHAN AK，DESALLE R，et al.New Insights Into Beclin-1：Evolution and Pan-Malignancy Inhibitor Activity［J］.Adv Cancer Res，2018，137：77-114.

［26］邵鑫，蔣先虹，王瑞，等.類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖及巨自噬的表達水平［J］.風濕病與關節炎，2021，10（1）：1-5，11.

［27］孔志偉，姚婷婷.自噬相關基因Beclin1和LC3與子宮內膜異位癥的研究進展［J］.醫學綜述，2019，25（21）：4166-4173.

（2021-05-24收稿 本文編輯：劉強）

基金項目：國家自然科學基金地區項目（81860890）；新疆維吾爾自治區科技廳面上項目（2017D1C210）作者簡介：丁霞（1995.04—），女，碩士研究生在讀，研究方向：民族醫藥治療免疫系統疾病的機制研究，E-mail：895925213@qq.com通信作者：霍新慧（1981.04—），女，博士，教授，研究方向：民族醫藥治療免疫系統疾病的機制研究，E-mail：xjhuoxinhui@126.com