超聲輔助酶解法提取杏鮑菇多糖工藝研究

孫法林，肖慧慧，侯笑林，張玉豪

（青島工學院食品工程學院，山東青島 266300）

杏鮑菇富有蛋白質、碳水化合物、維生素及鈣、銅、鎂等礦物質，可增強人體免疫力，對人體具有抗癌、降血脂及美容養顏作用[1]。天然多糖根據來源分為微生物多糖、動物多糖和植物多糖，廣泛存在動植物體內和微生物細胞壁中[2]，其作用幾乎涉及到機體免疫系統的各個方面，具有降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎癥等多種功效[3]。獲得多糖的方法常用的有熱水提取法、酸提取法、堿提取法和酶提取法等，其中酶技術是近年來廣泛應用的一項生物技術，加速多糖的釋放或提取[4]。

杏鮑菇多糖是杏鮑菇的主要活性成分之一，具有較高的藥用價值，并且對人體有保健功能。目前，食用菌多糖的酶法提取、超聲輔助提取等技術均已有報道，但酶法和超聲輔助聯合提取杏鮑菇多糖研究報道較少。在基于超聲處理作為基礎，采用纖維素酶法提取杏鮑菇多糖，進一步改善了提取工藝，為杏鮑菇下一步利用提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 原材料

杏鮑菇，當地超市采購，要求新鮮、無腐爛。

1.1.2 試驗試劑

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、纖維素酶、氫氧化鈉（GB/T 629—1997）、鹽酸（GB/T 622—2006），上海埃彼化學試劑有限公司提供。

1.1.3 儀器與設備

DHG-9240A 型BS 電熱恒溫鼓風干燥箱（60 目篩），上海康路儀器設備有限公司產品；80-2 型電動離心機、HH-6 型數顯恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司產品；JM-B5102 型分析天平，余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司產品；多功能粉碎機，鉑歐五金廠產品；722 型分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

選用新鮮、無蟲害的杏鮑菇，用清水洗凈，切片，60 ℃下烘干，用粉碎機將其研磨成粉末狀，過60 目篩，放于瓶中，干燥保存。

1.2.2 杏鮑菇多糖的提取

將去核的杏鮑菇置于恒溫干燥箱中，經烘干、粉碎，過60 目篩備用。準確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末于錐形瓶中，pH 值6.00 條件下，以料液比1∶30（g∶mL） 加入蒸餾水，超聲提取20 min，離心過濾后取上清液。向濾液中加入0.8%的纖維素酶，在酶解溫度60 ℃，酶解時間90 min 條件下進行酶解提取。將酶解液置于沸水浴中加熱10 min 滅酶，冷卻至室溫，離心過濾，得到杏鮑菇多糖提取液，用苯酚- 硫酸法測定提取液中多糖含量。

1.2.3 杏鮑菇多糖含量的測定及計算方法

采用苯酚- 硫酸分光光度法測定多糖含量。精確稱取105 ℃干燥至恒質量的葡萄糖100 mg 于500 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。分別量取0，0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0 mL 標準溶液于25 mL 試管中，加蒸餾水至2.0 mL并搖勻。分別加入新配制的苯酚試劑1.0 mL，濃硫酸5 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min后于波長490 nm 處測定吸光度，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線公式。

取杏鮑菇多糖提取液，按上述方法測吸光度，代入方程，求多糖含量，從而求多糖提取率。

1.2.4 單因素試驗

（1） 料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響。準確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末，在pH 值6.0 條件下，分別以料液比為1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL） 加入蒸餾水，超聲時間20 min，離心后取上清液，加入0.8%的纖維素酶，在60 ℃條件下酶解90 min，經滅酶、冷卻，測定多糖含量。

（2） pH 值對杏鮑菇多糖提取率的影響。準確稱取1.00 g杏鮑菇粉末，在最佳料液比條件下，分別調節pH 值至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，超聲時間20 min，離心后取上清液，加入0.8%的纖維素酶，在60 ℃條件下酶解90 min，經滅酶、冷卻，測定多糖含量。

（3） 超聲提取時間對杏鮑菇多糖提取率的影響。準確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末，在最佳料液比及pH 值條件下，分別以超聲時間10，15，20，25，30 min進行提取，離心后取上清液，加入0.8%的纖維素酶，于60 ℃條件下酶解90 min，經滅酶、冷卻，測定多糖含量。

（4） 酶添加量對杏鮑菇多糖提取率的影響。將超聲提取所得濾液中分別加入添加量為0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的纖維素酶，在60 ℃條件下酶解90 min，經滅酶、冷卻，測定多糖提取率。

（5） 酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響。向超聲提取后獲得的濾液中加入最佳添加量的纖維素酶，分別采用酶解溫度為50，55，60，65，70 ℃，酶解90 min。經滅酶、冷卻，測定多糖含量。

（6） 酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響。向超聲提取后獲得的濾液中加入最佳添加量的纖維素酶，在最佳酶解溫度條件下，分別設置酶解時間為70，80，90，100，110 min 進行酶解提取。經滅酶、冷卻，測定多糖提取率。

1.2.5 酶解過程的正交試驗設計

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

根據單因素試驗結果，選擇酶添加量、酶解溫度和酶解時間三因素進行正交試驗，分別對3 個因素設計3 個水平，以多糖提取率為評價指標，設計L9（33）正交試驗，優化杏鮑菇多糖提取工藝條件。

1.2.6 驗證試驗與傳統水提法的比較

準確稱取1.00 g 杏鮑菇，按照試驗得出的最佳提取工藝條件提取杏鮑菇多糖，重復3 次取平均值，并與傳統水提法提取杏鮑菇多糖比較提取效果。

2 結果與分析

2.1 料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響

料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖1 可知，提取率隨著料液比的增大而慢慢增大，當料液比為1∶30 時達到最高，隨著溶劑的繼續增加，多糖的提取率變化不大。溶劑量的增加，使得超聲波介質的液體增加，細胞內外部濃度差距變大，多糖提取率的上升是根據多糖類物質向外擴大的速度。當料液比達到1∶30 時，其提取量達到了極限，提取率不再提高。為了不讓隨后的工藝負荷壓力太大，提取劑的添加量不應過多，因此多糖提取效果最好的料液比為1∶30。

2.2 pH 值對杏鮑菇多糖提取率的影響

pH 值對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖2。

圖2 pH 值對杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著pH 值的增大，多糖提取率逐漸升高。當pH 值為6.0 時，多糖提取率最高；繼續增大pH 值，溶液酸堿性影響了酶和底物的空間結構，使得兩者的結合受到一定影響，同時加劇了杏鮑菇多糖的分解，導致多糖提取率的降低，因此多糖提取的最佳pH 值為6.0。

2.3 超聲時間對杏鮑菇多糖提取率的影響

超聲時間對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖3 可知，多糖提取率隨著超聲時間的延長不斷提高，20 min 時達到最大。超聲處理提高了顆粒內部的溫度和壓力，擴散速率加快；同時，由于超聲處理使細胞壁受到破碎而孔徑增大，利于細胞內多糖溶出；時間繼續延長，提取率呈下降趨勢，可能是由于超聲時間過長，降低了某些反應的活化能，從而導致糖結構的變化和破壞，也可能是由于蛋白質變性沉積在顆粒表面，導致多糖提取率下降。因此，超聲時間控制在20 min 為宜。

2.4 酶添加量對杏鮑菇多糖提取率的影響

酶添加量對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖4。

圖4 酶添加量對杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖4 可知，杏鮑菇多糖提取率會根據纖維素酶添加量的提高而上升，主要是底物與酶接觸面增大，使得酶對多糖提取效率大大提高。當纖維素酶添加量提高到0.8%時，纖維素酶與底物的接觸面積達到飽和狀態，接觸面積不再擴大，杏鮑菇多糖提取率會隨著酶添加量的增加不再上升，逐漸趨于于穩定。此時，杏鮑菇中多糖到提取率到達最高水平。因此，確定纖維素酶添加量為0.8%比較合理。

2.5 酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響

酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖5 可知，杏鮑菇多糖提取率根據酶解溫度的提高而上升，當溫度升高到60 ℃時多糖提取率最高。繼續提高酶解溫度，則會使得多糖提取率逐漸下降，因為在酶促反應中，反應物能量提高是根據溫度上升，加速酶的反應，若試驗溫度超過酶可接受最高溫度范圍，將會造成酶蛋白質變性或者失去活性，直接使得多糖提取率快速下降。因此，選擇60 ℃為最適宜的酶解溫度。

2.6 酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響

酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖6。

圖6 酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響

由圖6 可知，杏鮑菇多糖提取率會隨著酶解時間的不斷增加而上升，當酶解時間為90 min 時，杏鮑菇多糖提取率上升且趨于穩定；當時間到100 min時，多糖提取率達到最高水平；而在90～100 min 時多糖提取率增加并不顯著，主要是因為酶解持續時間過長，多糖在底物中含量過低，細胞內外的濃度差逐步減小，同時也加大了雜質在提取液中的溶解量，多糖提取率上升不明顯。隨著酶解時間的延長，多糖提取率變化不大。因此，選擇90 min 為最佳酶解時間。

2.7 酶解過程的正交試驗優化

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

由表2 極差分析，試驗中3 個因素的影響力大小順序為A＞C＞B，對應影響酶解杏鮑菇多糖提取率效果因素的強弱順序為酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度，且杏鮑菇多糖的最佳酶解工藝為A2B3C3，即酶添加量0.8%，酶解溫度65 ℃，酶解時間100 min。

2.8 驗證試驗與傳統水提法的比較

由于計算出的最優組合不包含在正交表中，因而按最優組合配方進行試驗驗證，得出杏鮑菇多糖提取率為28.06%，因此確定A2B3C3為杏鮑菇多糖的最佳酶解工藝條件。

在不加纖維素酶及超聲的條件下，按照傳統水提法，即料液比1∶30，pH 值6.0，提取時間20 min，提取溫度60 ℃進行杏鮑菇多糖的提取，可得杏鮑菇多糖提取率為18.32%。由此可知，超聲輔助酶解法可以明顯提高杏鮑菇多糖的提取率，原因可能是超聲配合纖維素酶能夠破壞植物細胞壁中的纖維素結構，促進多糖從杏鮑菇細胞中溶解出來。

3 結論

（1） 超聲輔助酶解法提取杏鮑菇多糖的最佳提取條件為料液比1∶30，pH 值6.0，超聲時間20 min，酶添加量0.8%，酶解時間100 min，酶解溫度66 ℃。在此工藝條件下杏鮑菇多糖提取率最高，為28.06%。

（2） 纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，性質穩定，在傳統水提法的條件下不易水解。試驗采用超聲輔助纖維素酶法提取杏鮑菇多糖，能有效提高杏鮑菇多糖提取率，其多糖提取率遠高于傳統水提法，同時提取溫度較低，反應條件溫和、快速、高效。