紫皮石斛花總黃酮提取工藝優化及抗氧化活性研究

董壽堂，任 遠，張旭強，王懷斌，魯 靜，胡 燕

（保山中醫藥高等專科學校，云南 保山 678000）

紫皮石斛為蘭科石斛屬植物齒瓣石斛（Dendrobium devoninum Paxt.），又名紫草、香棍草、紫皮蘭、水打棒、中黃草、旱馬棒等，其性微寒、味甘，歸胃、腎經，具有養胃生津、滋陰除熱之功效[1-2]，主要分布在我國的云南、貴州、廣西及西藏等，其中在云南龍陵有大量的人工種植，且品質好，故該縣于2011 年11 月被中國中藥協會授予“中國紫皮石斛之鄉”稱號，2012 年獲得了國家工商行政管理總局頒發的《地理標志證明商標注冊》證書。研究發現，紫皮石斛莖中含有氨基酸、多糖、酰胺類、苯丙素類、聯芐類、二氫菲類、酚酸類、二氫黃酮類、甾醇類及木脂素類等多種化學物質[3-6]，具有抗疲勞[7]、增強免疫[8]、抗氧化[9]及抗菌[10]等作用，且長期食用無明顯副作用[11]，未見胚胎毒性及致畸毒性[12]、遺傳毒性[13]，屬于無毒級物質[3，13]。由于對紫皮石斛花研究較少，而限制了其開發利用。紫皮石斛花在民間人們常常用來泡水、泡酒、榨汁、煮粥及煲湯等食用，認為其具有滋陰潤肺、美容養顏、安神解郁及養胃生津的功效，受到越來越多人的喜愛。現代研究發現，紫皮石斛花中含有多糖、多酚、多種氨基酸、粗蛋白質、類黃酮、多種礦物質及揮發性成分等[14-15]，并證實了紫皮石斛花乙醇提取物、多糖及氨基酸具有較好的體外抗氧化作用[16-17]。但紫皮石斛花總黃酮提取工藝及功效的研究鮮見報道。黃酮類化合物普遍存在于各種植物中，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤和調節免疫等作用[18]，有著廣泛的開發應用前景。因此，通過對紫皮石斛花總黃酮提取工藝及作用的研究，可為保健品、藥品的開發奠定基礎，從而提高紫皮石斛花開發應用價值。

以紫皮石斛花為原料，采用超聲波法提取總黃酮，在單因素試驗基礎上，通過響應面法優化紫皮石斛花總黃酮提取工藝條件，并探討紫皮石斛花總黃酮對超氧陰離子、DPPH 自由基及羥自由基的清除作用，為紫皮石斛花下一步的研究開發提供參考。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與試劑

YF-150 型高速中藥粉碎機，浙江省瑞安市永歷制藥機械有限公司產品；SQP 型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司產品；1524 型臺式普通離心機，丹麥Labogene 公司產品；SHA-2 型冷凍水浴恒溫振蕩器，金壇市盛威實驗儀器廠產品；SB-800DTD 型超聲清洗儀，寧波新藝超聲設備有限公司產品；UV-1800 型紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司產品；Elx808 型酶標儀，美國佰騰儀器有限公司產品。

紫皮石斛花，云南省保山市龍陵天和土特產商貿發展有限公司提供；L- 抗壞血酸（分析純），上海易恩化學技術有限公司提供；總黃酮試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、DPPH 自由基清除能力試劑盒，蘇州格銳思生物科技有限公司提供；無水甲醇、無水乙醇（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮提取

取干燥紫皮石斛花適量，于60 ℃下烘干至恒質量，粉碎、過60 目篩。稱取紫皮石斛花粉末0.03 g，按一定料液比加入一定體積分數的乙醇，浸泡12 h，于一定溫度，800 W 超聲波下提取一定的時間，以轉速12 000 r/min 離心10 min，取上清液，用60%乙醇定容至1.5 mL，備用。

1.2.2 總黃酮含量測定

按照“總黃酮試劑盒說明書”操作方法，采用酶標儀于波長510 nm 處測定吸光度。根據說明書中回歸方程Y=1.627 7X-0.004 9（R2=0.999 9），計算紫皮石斛花總黃酮質量濃度，依據公式（1） 得出總黃酮提取率。

式中：C——回歸方程中得出的紫皮石斛花總黃酮質量濃度，mg/mL；

V——提取液定容后體積，mL；

W——樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗

（1） 乙醇體積分數對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL），分別加40%，50%，60%，70%，80%乙醇，在溫度60 ℃下以800 W 功率超聲提取30 min，考查不同乙醇體積分數對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

（2） 料液比對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱取0.03 g 紫皮石斛花粉末，分別以料液比為1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50（g∶mL） 加入60%乙醇，于60 ℃的溫度下以800 W 功率超聲提取30 min，考查不同料液比對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

（3） 提取溫度對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL） 加60%乙醇，并分別于40，50，60，70，80 ℃的溫度下以800 W 功率超聲提取30 min，考查不同提取溫度對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

（4） 提取時間對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL） 加入60%乙醇，并在溫度60 ℃下以800 W功率超聲分別提取20，25，30，35，40 min，考查不同提取時間對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

1.3 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，分別確定乙醇體積分數（A）、液料比（B）、提取溫度（C） 及提取時間（D）四因素的3 個水平。利用Design Expert 8.0.6 軟件中Box-behnken 方法設計優化試驗方案，以紫皮石斛花總黃酮提取率（Y） 為響應值，確定紫皮石斛花總黃酮提取的最佳工藝。

Box-behnken 試驗設計因素與水平設計見表1。

表1 Box-behnken 試驗設計因素與水平設計

1.4 體外抗氧化試驗

1.4.1 溶液制備

（1） 紫皮石斛花總黃酮溶液的配制。稱取1.20 g紫皮石斛花粉末，按照最佳提取工藝條件進行提取，并根據2.3.2 中方法測定其含量，然后用蒸餾水將其配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mg/mL溶液，4 ℃下保存備用。

（2） L- 抗壞血酸溶液的配制。稱取L- 抗壞血酸100 mg，用適量的蒸餾水溶解，并定容至100 mL，再用蒸餾水配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mg/mL 溶液，4 ℃下保存備用。

1.4.2 清除超氧陰離子能力的測定

按照“超氧陰離子清除能力試劑盒說明書”操作方法，分別測定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L - 抗壞血酸溶液的吸光度，并根據說明書中的公式（2） 計算超氧陰離子清除率。

式中：A測定——測定管的吸光度；

A對照——對照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.4.3 清除DPPH 自由基能力的測定

按照“1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基清除能力試劑盒說明書”操作方法，分別測定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L - 抗壞血酸溶液的吸光度，并根據說明書中的公式（3） 計算DPPH 自由基清除率。

式中：A測定——測定管的吸光度；

A對照——對照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.4.4 清除羥自由基能力的測定

按照“羥自由基清除能力試劑盒說明書”操作方法，分別測定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L- 抗壞血酸溶液的吸光度，并根據說明書中的公式

（4） 計算羥自由基清除率。

式中：A測定——測定管的吸光度；

A對照——對照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.5 統計方法

所有試驗數據均為平行測定3 次所得，用均數±標準差表示，利用Excel、Design Expert 8.0.6、Sigma Plot 10.0 軟件進行數據統計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分數對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖1 可知，隨著乙醇體積分數增加，紫皮石斛花總黃酮提取率先增加后降低，當乙醇體積分數達到60%時，總黃酮提取率最大。而乙醇體積分數超過60%后，總黃酮提取率反而下降，其可能是乙醇體積分數增加，降低了總黃酮類溶解性，并增加了其他醇溶性雜質溶出，導致總黃酮提取率降低[19]。因此，選擇50%～70%乙醇優化提取工藝。

2.1.2 料液比對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

料液比對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖2 可知，隨著料液比增加，總黃酮提取率呈現先增后降趨勢。當料液比達到1∶35（g∶mL）時，總黃酮提取率為最高，而料液比超過1∶35（g∶mL） 后，總黃酮提取率逐漸降低，可能是料液比的提高，增加了其他雜質溶出，從而降低了總黃酮提取率[19]。因此，選擇1∶35～1∶45（g∶mL） 料液比優化提取工藝。

2.1.3 提取溫度對紫皮石斛花黃酮提取率的影響

提取溫度對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖3 可知，隨溫度增加，總黃酮提取率先增后降，當溫度為70 ℃時，提取率最高，而溫度超過70 ℃，提取率有所下降，其可能是由于溫度的提高，破壞了部分黃酮，導致總黃酮提取率降低[19]。因此，選擇60～80 ℃提取溫度優化提取工藝。

2.1.4 提取時間對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

提取時間對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖4 可知，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率先增加后降低，當提取時間為25 min 時，提取率達到最大值，而提取時間超過25 min，總黃酮提取率不斷降低，其可能是提取時間延長，導致部分黃酮被破壞[19]。因此，選擇20～30 min 提取時間優化提取工藝。

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗結果

以A、B、C、D 4 個因素為自變量，響應值為Y，利用Box-behnken 試驗原理設計響應面試驗。

Box-behnken 響應面試驗及結果見表2。

表2 Box-behnken 響應面試驗及結果

2.2.2 回歸模型方差分析

采用Design Expert 8.0.6 軟件對表2 中試驗數據進行多元回歸分析，得到紫皮石斛花總黃酮提取率對自變量的二元多項回歸方程為：

Y=2.56-0.24A-0.047B+0.100C+0.033D-0.023AB+0.045AC-0.020AD-0.025BC-0.068BD+0.030CD-0.028A2+0.24B2+0.13D2+0.11D2。

回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析

由表3 可知，回歸模型具有顯著性（p＜0.05），失擬項不顯著（p＞0.05），模型回歸方程的相關系數R2=0.723 5，說明該模型回歸方程擬合度好，具有較好的準確性及可信度。A、B2具有極顯著性（p＜0.01），提示乙醇體積分數及二次項料液比對紫皮石斛花總黃酮提取率影響極顯著。由表中F 值可知，影響紫皮石斛花總黃酮提取率的因素順序為A＞C＞B＞D。

2.2.3 響應面分析與優化

乙醇體積分數與料液比對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖見圖5，乙醇體積分數與提取溫度對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖見圖6，乙醇體積分數與提取時間對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖見圖7，料液比與提取溫度對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖見圖8，料液比與提取時間對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖見圖9，提取溫度與提取時間對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖見圖10。

圖5 乙醇體積分數與料液比對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖

圖6 乙醇體積分數與提取溫度對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖

圖7 乙醇體積分數與提取時間對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖

圖8 料液比與提取溫度對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖

圖9 料液比與提取時間對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖

圖10 提取溫度與提取時間對總黃酮提取率影響的響應面及等高線圖

響應面分析圖中響應面坡度、等高線密集度及形狀可反映兩因素交互作用是否顯著。響應面坡度越大，等高線越密集并呈橢圓形，說明兩因素交互作用顯著；反之，響應面坡度越小，等高線越稀疏并呈圓形，說明兩因素交互作用不顯著[27-30]。因此，由圖5 ～圖10 可知，各圖的響應面坡度小，等高線不密集并呈橢圓形，提示AB、AC、AD、BC、BD及CD 因素交互作用不顯著。

2.2.4 最佳提取工藝預測及驗證

通過二元多項回歸方程可預測得到紫皮石斛花總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分數60.17%，料液比1∶35.14（g∶mL），提取溫度69.97 ℃，提取時間29.00 min，在此條件下總黃酮提取率可達3.41%，為了試驗的可操作性，將以上的最佳工藝修正為乙醇體積分數60%，料液比1∶35（g∶mL），提取溫度70 ℃，提取時間29 min，在該條件下平行重復3 次試驗，得到總黃酮提取率為3.54%±0.013%，接近于預測值，說明二元多項回歸方程模型擬合度較好，可用于紫皮石斛花總黃酮的提取。

2.3 體外抗氧化試驗結果

2.3.1 紫皮石斛花總黃酮對超氧陰離子的清除作用

紫皮石斛花總黃酮對超氧陰離子的清除作用見圖11。

圖11 紫皮石斛花總黃酮對超氧陰離子的清除作用

由圖11 可知，在質量濃度0～0.8 mg/mL 范圍內，紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對超氧陰離子清除率存在量效關系，清除率隨著質量濃度的增加而提高，當質量濃度達到0.8 mg/mL 時，清除率達到最大，分別為61.41%，86.80%，對超氧陰離子的半數抑制質量濃度（Half inhibitory concentration，IC50） 分別為0.32，0.08 mg/mL，說明紫皮石斛花總黃酮具有較好的清除超氧陰離子能力，但要比L - 抗壞血酸的清除能力弱。

2.3.2 紫皮石斛花總黃酮對DPPH 自由基的清除作用

紫皮石斛花總黃酮對DPPH 自由基的清除作用見圖12。

圖12 紫皮石斛花總黃酮對DPPH 自由基的清除作用

由圖12 可知，在質量濃度0～0.8 mg/mL 范圍內，紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對DPPH 自由基清除率存在量效關系，清除率隨著質量濃度的增加而提高，當質量濃度達到0.8 mg/mL 時，清除率達到最大，分別為86.70%，89.28%，對DPPH 自由基的IC50分別為0.17，0.003 mg/mL，說明紫皮石斛花總黃酮具有較強的清除DPPH 自由基能力，但不及L - 抗壞血酸。

2.3.3 紫皮石斛花總黃酮對羥自由基的清除作用

紫皮石斛花總黃酮對羥自由基的清除作用見圖13。

圖13 紫皮石斛花總黃酮對羥自由基的清除作用

由圖13 可知，在質量濃度0～0.8 mg/mL 范圍內，紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對羥自由基清除率存在量效關系，清除率隨著質量濃度的增加而提高，當質量濃度達到0.8 mg/mL 時，清除率達到最大，分別為31.50%，86.39%，對羥自由基清除率的IC50分別為0.42，0.18 mg/mL，說明紫皮石斛花總黃酮具有一定的清除羥自由基能力，但比L - 抗壞血酸的清除能力弱。

3 結論

在單因素試驗分析乙醇體積分數、料液比、提取溫度及提取時間對紫皮石斛花總黃酮提取率影響的基礎上，利用響應面試驗方法對紫皮石斛花總黃酮提取工藝進行優化，得到最佳提取工藝條件為乙醇體積分數60%，料液比1∶35（g∶mL），提取溫度70 ℃，提取時間29 min，在此條件下，紫皮石斛花總黃酮平均提取率為3.54%，與預測值3.41%接近，提示該提取工藝可用于紫皮石斛花總黃酮的提取。通過體外抗氧化試驗結果顯示，在0～0.8 mg/mL質量濃度范圍內，紫皮石斛花總黃酮的抗氧化作用存在量效關系，其對超氧陰離子、DPPH 自由基、羥自由基最大清除率分別為61.41%，86.70%，31.50%，IC50分別為0.32，0.17，0.42 mg/mL，說明紫皮石斛花總黃酮具有較好的抗氧化作用。該研究可為紫皮石斛花總黃酮的提取及其相關保健品、藥品等方面的研究開發提供參考。