新疆維吾爾族異基因造血干細胞移植病兒血漿中伏立康唑的濃度測定

趙婷，張惠蘭，沈浩，馮杰，劉思明，王婷婷，李紅健，于魯海

伏立康唑（voriconazole）可用于預防接受異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell，HSCT）的高危病人的侵襲性真菌感染［1-2］。伏立康唑具有非線性動力學特征［3］，血藥濃度治療窗狹窄（0.5～5.0 mg/L）［4］。目前，伏立康唑在維吾爾族異基因HSCT高危病兒中的治療藥物監測數據有限。因此，我們采用高效液相色譜-質譜聯用（liquid chromatogra?phy-tandem mass spectrometry assay，LC-MS/MS）技術來靈敏、快速檢測伏立康唑穩態血漿谷濃度，并探討伏立康唑血漿谷濃度在異基因HSCT 病兒中的分布特征。

1 方法

1.1 儀器、試劑和試藥高效液相色譜-質譜聯用儀（4500 型，上海AB SCIEX 分析儀器有限公司）；電子天平（BP221S型，德國賽多利斯公司）。伏立康唑和伏立康唑同位素內標均購自中國食品藥品檢定研究院（純度>98%）；色譜甲醇、甲酸（美國Fisher公司）。

1.2 色譜及質譜條件色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（3.0×50 mm，2.5 μm），流動相A：0.1%的甲酸水溶液，流動相B：0.1%的甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0~0.2 min，A 95%~B 5%；0.2~1.2 min，A 70%，B 30%；1.2~2.4 min，A 30%，B 70%；2.4~1.3 min，A95%，B 95%）；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流速0.4 mL/min。

質譜條件：正離子模式；離子噴射電壓：5 500 V；溫度：600 ℃；GSl：50；GS2：50；Curtain gas：30。伏立康唑離子對350.2/127.1，同位素內標離子對353.2/130.1，碰撞能量均為20 eV。

1.3 溶液的配置精密稱取伏立康唑內標10 mg和同位素內標1 mg，用甲醇配置成濃度為1 mg/L 儲備液和5 mg/L 內標溶液。再稀釋配制伏立康唑標準曲線系列溶液（濃度為2、5、10、20、50、100、200 mg/L）。同時，以甲醇分別配置4 種具有代表性伏立康唑濃度水平的質控樣品溶液，即定量下限（lower limit of quantification，LLOQ，2.0 mg/L）、低濃度質控（low quality control，LQC，5.0 mg/L）、中濃度質控（middle quality control，MQC，60.0 mg/L）和高濃度質控（high quality control，HQC，150.0 mg/L）。

1.4 方法學考查

1.4.1專屬性考察 測定并記錄空白血漿、空白血漿+伏立康唑標準液、空白血漿+內標、空白血漿+伏立康唑標準液+內標和病兒樣品色譜圖，具體見圖1。

圖1 伏立康唑和內標色譜圖：A為空白血漿；B為空白血漿+內標；C為空白血漿+伏立康唑；D為病兒血漿樣品

1.4.2線性關系考察和定量下限測定 在80 μL 空白血漿中分別加入伏立康唑標準系列濃度溶液10μL 和內標溶液10 μL，得到0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L 的系列標準血漿樣本溶液后進樣分析。以伏立康唑與內標的色譜峰面積比值為應變量，濃度為自變量，用加權最小二乘法進行回歸分析。以信噪比S/N≥4 考察該藥物的檢測下限，信噪比S/N≥12考察該藥物的定量下限。

1.4.3方法精密度和準確度 配制LLOQ（0.2 mg/L）、LQC（0.5 mg/L）、MQC（6.0 mg/L）和HQC（15.0 mg/L）4 個濃度的質控生物樣品各5 份，每個濃度進樣3 針，連續測定3 d，計算日內、日間精密度和準確度。

1.4.4提取回收率 配制LLOQ、LQC、MQC 和HQC 4 個濃度的伏立康唑質控標準溶液和生物樣品各6份，進樣分析，并計算提取回收率。

1.4.5穩定性試驗 分別考察LQC 和HQC 的質控生物樣品室溫穩定性（室溫放置4 h）、短期穩定性（-4 ℃，24 h）、長期穩定性（-30 ℃，30 d）、凍融穩定性（-24 ℃下反復凍融3次，每次至少間隔12 h）。穩定性質控樣品按上述條件分別放置一段時間后進行色譜分析，比較其測定值與0 h 質控樣品測定值的偏差。

1.5 病兒樣品測定及臨床資料收集收集204 例就診于新疆維吾爾自治區人民醫院血液科并規律服用伏立康唑的維吾爾族異基因HSCT 的病兒。所有病兒在測定當日早晨空腹抽取靜脈血1~2 mL（3 500 r/min，-4 ℃離心5 min），分離血漿后精密吸取50 μL，加入內標10 μL，蛋白沉淀劑200 μL，混合離心（12 000 r/min，10 min）后過濾測定。收集并隨訪了所有入組病兒的一般資料（年齡、性別、體質量指數、服藥劑量等）和穩態血漿谷濃度。病人或其近親屬知情同意，本研究經新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審核批準（批號XJS2021111809）。

2 結果

2.1 專屬性研究結果顯示：伏立康唑的離子對躍遷的離子對：350.2/127.1，同位素內標的離子對躍遷的離子對：353.2/130.1。圖1 顯示了伏立康唑和IS的離子對躍遷的代表性色譜圖。在伏立康唑的洗脫和無藥物空白人血漿中的IS 中未檢測到干擾峰。在LLOQ 樣品（圖1C）和給藥后產生的樣品（圖1D）中，伏立康唑和IS 保留時間均約1.84 min。此外，在定量樣品上限（20 mg/L）之后注入的空白血漿樣品的色譜圖中未檢測到殘留。

2.2 線性關系考察和定量下限測定伏立康唑血藥濃度在0.2~20 mg/L 范圍內線性關系良好（Y=1.107 2X-0.051 3，r2≥0.999 7），檢測下限為0.1 mg/L（S/N=4），定量下限為0.2 mg/L（S/N=12）。

2.3 方法精密度和準確度伏立康唑測定的日內和日間精密度使用四個水平的質控樣品進行評估，包括LLOQ、LQC、MQC 和HQC（見表1）。表1 結果表明：日內和日間精密度的變異系數（coefficient of variation，CV）值不超過7.39%，準確度的偏差（devia?tion from nominal value，Bias）范圍為- 1.11%~14.56%。

表1 精密度和準確度結果（伏立康唑血藥濃度）

2.4 提取回收率伏立康唑的4 個質控樣品（LLOQ、LQC、MQC 和HQC）的提取回收率分別為85.46%、90.78%、95.55%和94.11%，RSD 值均小于15.0%。IS的平均絕對值為86.41%。見表2。

表2 伏立康唑的提取回收率

2.5 穩定性試驗穩定性試驗結果表明，伏立康唑的2個質控樣品（LQC和HQC）的未前處理和經過前處理血漿樣品的短期、長期和凍融凍存穩定性均較好（CV<5%；Bias 為-0.28%～12.29%；CV<10%；Bias為-3.56%～2.85%）。見表3。

表3 伏立康唑的穩定性試驗結果

2.6 伏立康唑血漿藥物濃度測定結果分析病兒一般資料見表4。病兒平均年齡為10.13 歲；男性病兒比例為67.65%（n=138），伏立康唑平均給藥劑量為14.31 mg/d，血漿谷濃度為3.11 mg/L。

表4 規律服用伏立康唑的維吾爾族異基因造血干細胞移植（HSCT）病兒204例一般臨床資料

3 討論

本研究首次建立的測定伏立康唑血藥谷濃度的LC-MS/MS 方法基于臨床實踐病人樣本，提供了臨床環境的真實代表。

3.1 測定方法的優缺點優點：目前測定伏立康唑血藥濃度的高效液相色譜法［5-9］和LC-MS/MS 法［9-11］在樣品量、樣品制備方法、色譜柱等方面有所不同。有研究［12-15］使用了較為復雜的固相萃取、液-液萃取，或更昂貴的色譜設備。我們建立的LC-MS/MS方法使用了較為簡單的蛋白質沉淀方法，可以將實驗操作過程減少到四個步驟，檢測人員可以快速輕松的完成相關操作，如15個伏立康唑血漿樣品可以在20 min 內完成所有前處理過程。本研究建立的LC-MS/MS 法的分析速度快、靈敏度高，一次樣品的運行時間在3 min 內就可以完成，可及時為臨床個體化用藥提供依據。此外，該方法只需要50 μL 的血漿，這使得該方法可以更好的應用于兒童病人。

缺點：由于該LC-MS/MS 法的靈敏度較高，故測定的各個環節對測定的干擾均較大，尤其是樣本前處理過程。其次，該儀器比較昂貴，不能廣泛應用于新疆的邊遠地區。

3.2 操作過程中的注意事項（1）本方法的流動相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，因此，采用有機相和水相相結合的混合膜。（2）流動相必須脫氣處理，否則會造成基線不穩。（3）由于本研究測定的是生物樣本，樣本的前處理中的除蛋白過程對色譜系統的干擾較大，因此，樣本經0.22 μm 過濾器過濾后再進樣測定。

3.3 研究意義目前，我院的伏立康唑樣品被送到其他實驗室進行血藥濃度測定，其存在的主要問題是3～6 d 的周轉時間，使臨床調整其給藥劑量不及時。為了解決這個問題，我們開發并驗證了一種適用于兒科病人的快速、靈敏的LC-MS/MS 定量伏立康唑方法血漿谷濃度。此外，伏立康唑血漿谷濃度<1 mg/L 時治療效果較差［16-18］。伏立康唑谷濃度>5 mg/L 時易引發藥物的毒性反應［19-20］。本研究結果顯示有9例病兒伏立康唑血漿谷濃度<0.5 mg/L導致療效較差，26 例伏立康唑谷濃度>6 mg/L 的病兒引發了谷丙和谷草轉氨酶升高。因此臨床及時進行伏立康唑治療藥物監測是非常有必要的。