高通量測(cè)序技術(shù)聯(lián)合瞬態(tài)誘發(fā)性耳聲發(fā)射技術(shù)在新生兒遺傳性聾篩查中的應(yīng)用價(jià)值研究

劉詠梅，馮會(huì)穎，殷美樂(lè)，李文，桑艷峰

耳聾是常見(jiàn)的單基因遺傳病，也是常見(jiàn)的出生缺陷之一，我國(guó)新生兒耳聾的發(fā)生率約為1‰～3‰，高危新生兒聽(tīng)力障礙發(fā)生率則高達(dá)2%～4%，且高危新生兒發(fā)生遲發(fā)性聽(tīng)力損失的風(fēng)險(xiǎn)更高，每年約有3萬(wàn)重度聽(tīng)障新生兒出生［1-2］。因此盡早對(duì)新生兒開(kāi)展聽(tīng)力篩查非常有必要。高通量測(cè)序（NGS）技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的新型DNA 測(cè)序技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于新生兒遺傳性疾病的篩查中，但部分新生兒雖存在耳聾基因異常，但現(xiàn)階段對(duì)聲音反應(yīng)較好，與篩查結(jié)果不符［3］。瞬態(tài)誘發(fā)性耳聲發(fā)射（TEO?AE）技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外篩查新生兒耳聾的常用方法之一，具有測(cè)試簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但單獨(dú)采用TEOAE 對(duì)高危新生兒進(jìn)行聽(tīng)力篩查時(shí)，仍然會(huì)丟失部分病兒有聽(tīng)力障礙的檢查信息，造成漏診［4-5］。基于此，本研究嘗試探討NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE技術(shù)在新生兒遺傳性聾篩查中的應(yīng)用價(jià)值，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用整群隨機(jī)抽樣方法，根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)選取2018年1月至2020年10月承德市中心醫(yī)院625例新生兒作為研究對(duì)象，男419例，女206例；分娩孕周（38.26±1.62）周，范圍為35～42周；出生體質(zhì)量（3.86±0.65）kg，范圍為2.3～5.2 kg；剖宮產(chǎn)218例，順產(chǎn)407例；新生兒輕度窒息52例，新生兒重度窒息18例，無(wú)新生兒窒息555例；有家族耳聾史20例。本研究獲承德市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批號(hào)院科倫審（2017）倫審第（1162）號(hào)］，所有新生兒近親屬均知曉本研究，已簽署知情同意書(shū)。排除不愿參與篩查者。

1.2 方法所有新生兒均于出生后3～7 d 內(nèi)采用NGS技術(shù)和TEOAE技術(shù)行新生兒耳聾篩查，并于出生后1個(gè)月、2個(gè)月采用TEOAE技術(shù)進(jìn)行第1、2次復(fù)篩。

NGS 技術(shù)篩查方法：采集新生兒足跟血制成≥8 mm 的干血斑，于4 ℃保存，采用Mag Pure Blood DNA LQ Kit 提取干血斑中的模板基因組DNA，并利用Qubit 熒光計(jì)（賽默飛世爾科技）進(jìn)行定量分析。采用引物-特異性標(biāo)簽序列進(jìn)行多重PCR 技術(shù)構(gòu)建DNA 文庫(kù)并定量，利用OneTouch2 自動(dòng)化乳液PCR儀擴(kuò)增測(cè)序模板并使用ES磁珠純化儀進(jìn)行富集，采用BioelectronSeq 4000高通量測(cè)序儀（北京博奧生物有限公司）測(cè)序，共檢測(cè)18個(gè)常見(jiàn)耳聾基因的共100個(gè)位點(diǎn)。采用Ion PI Hi-Q Sequencing 200Kit 試劑盒，檢測(cè)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

TEOAE技術(shù)篩查方法：先行外耳道檢查，將新生兒外耳道分泌物、胎脂等清除，待新生兒睡著后進(jìn)行檢查，要求檢查環(huán)境噪聲<40 dB（A），采用Accu-Screen便攜式耳聲發(fā)射儀（丹麥MADSEN公司生產(chǎn)），參數(shù)設(shè)置：疏波短聲刺激，脈寬80 μs，非線(xiàn)性給聲測(cè)試頻率1.5～4.5 KHZ，刺激強(qiáng)度70～84 dB最小聲壓級(jí)。將大小合適的耳塞置入外耳道，并與篩查儀探頭連接，耳塞尖端小孔正對(duì)鼓膜，必要時(shí)放置于外耳道外1/3處，開(kāi)始測(cè)試，篩查儀自動(dòng)顯示結(jié)果（PASS為通過(guò)，REFER為未通過(guò)），并分別于出生后1、2個(gè)月進(jìn)行復(fù)篩。

聽(tīng)力診斷：NGS技術(shù)篩查和TEOAE技術(shù)復(fù)篩中有一種未通過(guò)者，需要在出生后3～6個(gè)月轉(zhuǎn)診至省級(jí)衛(wèi)生行政部門(mén)指定的聽(tīng)力障礙診治機(jī)構(gòu)接受進(jìn)一步診斷，新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房嬰兒出院前行自動(dòng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)（AABR）篩查，未通過(guò)者直接轉(zhuǎn)診至聽(tīng)力障礙診治機(jī)構(gòu)。診斷流程：（1）病史采集；（2）耳鼻喉科檢查；（3）聽(tīng)力測(cè)試，包括電生理、行為聽(tīng)力測(cè)試，主要為聲導(dǎo)抗（含1 000 Hz探測(cè)音）、耳聲發(fā)射（OAE）、聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）及行為測(cè)聽(tīng)等疾病測(cè)試；（4）輔助檢查，必要時(shí)進(jìn)行相關(guān)影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)室輔助檢查。儀器分別為：診斷型聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀（美國(guó)智聽(tīng)聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀SmartEP M010000），診斷型耳聲發(fā)射儀（美國(guó)智聽(tīng)耳聲發(fā)射儀SmartOAE），診斷型聲導(dǎo)抗儀（日本理音聲導(dǎo)抗儀RS-H1），診斷型聽(tīng)力計(jì)（麥力聲聽(tīng)力計(jì)AD104）。AABR 恒定強(qiáng)度35 dB 小樣本聽(tīng)力級(jí)，測(cè)聽(tīng)標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)聽(tīng)方法按照GB/T16403-1996 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；測(cè)聽(tīng)設(shè)備校準(zhǔn)按照J(rèn)JG388-2001 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；校準(zhǔn)聽(tīng)力計(jì)標(biāo)準(zhǔn)零級(jí)按照GB4854-84 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；測(cè)聽(tīng)環(huán)境按照GB/T16403、GB/T16296國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。明確診斷為永久性聽(tīng)力損失的病兒，須在6個(gè)月內(nèi)開(kāi)展科學(xué)干預(yù)和康復(fù)訓(xùn)練。

1.3 觀察指標(biāo)（1）統(tǒng)計(jì)NGS技術(shù)篩查結(jié)果。（2）新生兒≥2 個(gè)耳聾基因位點(diǎn)異常結(jié)果。（3）TEOAE 技術(shù)篩查、復(fù)篩結(jié)果。（4）聽(tīng)力診斷及NGS技術(shù)聯(lián)合TEO?AE技術(shù)篩查結(jié)果，兩種篩查結(jié)果均為陽(yáng)性判定為聯(lián)合篩查陽(yáng)性。（5）分析NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 軟件，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)描述，篩查價(jià)值分析采用受試者操作特征（ROC）曲線(xiàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGS 技術(shù)篩查結(jié)果本組共納入625 例新生兒，NGS 技術(shù)篩查檢出38 例耳聾基因異常（未通過(guò)），耳聾基因異常率為6.08%（38/625），其中GJB2基因異常15 例（2.40%），SLC26A4 基因異常17 例（2.72%），GJB3 基因異常3 例（0.48%），MT-RNR1 基因異常1 例（0.16%），MT-CO1 基因異常1 例（0.16%），MT-TL1基因異常1例（0.16%）；587例新生兒NGS技術(shù)篩查通過(guò)。見(jiàn)表1。

表1 新生兒NGS技術(shù)篩查結(jié)果（n=625）

2.2 新生兒≥2 個(gè)耳聾基因位點(diǎn)異常結(jié)果NGS技術(shù)篩查檢出的38 例耳聾基因異常新生兒中，共有5 例存在≥2 個(gè)耳聾基因位點(diǎn)異常，占比0.80%（5/625）。見(jiàn)表2。

表2 新生兒≥2個(gè)耳聾基因位點(diǎn)異常結(jié)果（n=625）

2.3 TEOAE 技術(shù)篩查結(jié)果本組共納入625 例新生兒，TEOAE 技術(shù)初篩有53 例未通過(guò)，占比8.48%（53/625），第1 次復(fù)篩有40 例未通過(guò)，占比6.40%（40/625），第2 次復(fù)篩有32 例未通過(guò)，占比5.12%（32/625）；TEOAE 技術(shù)第2 次復(fù)篩未通過(guò)的32 例新生兒中，18例未通過(guò)雙耳檢測(cè)，8例未通過(guò)單側(cè)左耳檢測(cè)，6例未通過(guò)單側(cè)右耳檢測(cè)。見(jiàn)表3。

2.4 聽(tīng)力診斷及NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)篩查結(jié)果NGS 技術(shù)篩查38 例未通過(guò)，587 例通過(guò)；TEOAE 技術(shù)復(fù)篩32 例未通過(guò)，593 例通過(guò)；聯(lián)合篩查25 例未通過(guò)，600 例通過(guò)；最終經(jīng)聽(tīng)力診斷有23例確診為遺傳性聾，602例聽(tīng)力診斷。見(jiàn)表4。

表4 聽(tīng)力診斷及NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE技術(shù)篩查結(jié)果/例

2.5 NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的價(jià)值以聽(tīng)力診斷確診的23 例遺傳性聾新生兒為陽(yáng)性樣本，602 例聽(tīng)力正常的新生兒為陰性樣本，繪制ROC 曲線(xiàn)，結(jié)果顯示，NGS 技術(shù)、TEOAE技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的曲線(xiàn)下面積（AUC）分別為0.92、0.88，二者聯(lián)合篩查的AUC為0.98。見(jiàn)表5。

表5 NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE技術(shù)篩查新生兒遺傳性聾的價(jià)值

3 討論

新生兒耳聾是導(dǎo)致兒童殘障的重要原因之一，不僅嚴(yán)重影響新生兒的生長(zhǎng)和發(fā)育，還會(huì)給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)［6-7］。早期發(fā)現(xiàn)新生兒耳聾，盡早開(kāi)展相關(guān)治療和干預(yù)，對(duì)促進(jìn)病兒健康成長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用［8］。

新生兒耳聾的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，包括遺傳因素和環(huán)境因素，其中約60%的耳聾是由遺傳因素造成［9］。國(guó)際上已鑒定出97 個(gè)非綜合征型耳聾基因，共152 個(gè)相關(guān)位點(diǎn)，而臨床研究常見(jiàn)耳聾基因以GJB2、SLC26A4、GJB3 等為主［10-11］。近年來(lái)，隨著NGS 技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，其能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定，因此越來(lái)越多的研究者開(kāi)始利用NGS 技術(shù)增加基因檢測(cè)種類(lèi)，以期盡早發(fā)現(xiàn)耳聾基因異常［12-13］。本研究通過(guò)NGS 技術(shù)對(duì)新生兒開(kāi)展遺傳性聾篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)625 例新生兒中6.08%存在耳聾基因異常，與王雪超等［14］報(bào)道的6.67%相近，略高于陽(yáng)彥等［15］報(bào)道的4.05%，造成此差異的原因可能與各地遺傳背景、檢測(cè)基因位點(diǎn)多等存在差異有關(guān)。耳聾基因異常新生兒中，2.40%為GJB2 基因異常，2.72%為SLC26A4 基因異常，GJB3 基因、MT-RNR1 基因等異常率相對(duì)較低，且少部分新生兒存在≥2 個(gè)耳聾基因位點(diǎn)異常，與國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究［16-17］結(jié)果相近，提示國(guó)內(nèi)新生兒耳聾基因異常情況存在一定相似性。而本研究中SLC26A4 基因（2.72%）異常率最高，這種差別可能與地域性差異、二代測(cè)序技術(shù)有關(guān)。但部分經(jīng)NGS 技術(shù)篩查未通過(guò)的新生兒經(jīng)聽(tīng)力診斷發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯聽(tīng)力損傷，后期隨訪對(duì)聲音反應(yīng)較好，這可能與隨訪時(shí)間較短有關(guān)，部分病兒哭可能發(fā)生了遲發(fā)性聽(tīng)力損失，短期隨訪并不能發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力損傷，仍需延長(zhǎng)隨訪進(jìn)一步驗(yàn)證。也可能與NGS 技術(shù)篩查也存在一定假陽(yáng)性率有關(guān)，如在新生兒重癥監(jiān)護(hù)室中，部分早產(chǎn)兒會(huì)因?yàn)槠鞴傧到y(tǒng)不成熟，導(dǎo)致NGS 出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，隨著早產(chǎn)兒器官系統(tǒng)逐漸成熟，隨訪復(fù)查時(shí)聽(tīng)力系統(tǒng)可表現(xiàn)為正常。由此可見(jiàn)，因此單獨(dú)采用NGS 技術(shù)篩查仍存在一定誤診率。

TEOAE 技術(shù)也是耳聾篩查中廣泛應(yīng)用的方法，該技術(shù)以機(jī)械振動(dòng)的形式起源于耳蝸，耳蝸受到外界短暫脈沖聲（一般為短聲或短音，時(shí)程在數(shù)毫秒以?xún)?nèi)）刺激后經(jīng)聽(tīng)骨鏈及鼓膜傳導(dǎo)釋放入外耳道的音頻能量，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行定量分析以發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力損傷情況［18］。本研究中，TEOAE 技術(shù)初篩8.48%的新生兒未通過(guò)，而第1、2 次復(fù)篩未通過(guò)率分別為6.40%、5.12%，均有不同程度降低，表明僅采用TEOAE技術(shù)進(jìn)行初篩并不能滿(mǎn)足篩查需求，其原因可能在于TEOAE 技術(shù)初篩易受多種因素的影響，如新生兒哭鬧、耳道內(nèi)殘留羊水、外耳道中殘留胎脂或存在環(huán)境噪聲，均會(huì)影響篩查結(jié)果，因此單次使用TEOAE篩選容易出現(xiàn)錯(cuò)誤信息，進(jìn)行復(fù)篩非常有必要［19］。此外，TEOAE 技術(shù)篩查法僅對(duì)耳蝸外毛細(xì)胞功能狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，若新生兒的聽(tīng)力損傷源于耳蝸后，其篩查結(jié)果則顯示正常，導(dǎo)致漏診［20］。表明單獨(dú)采用TEOAE 技術(shù)對(duì)新生兒遺傳性聾進(jìn)行篩查也存在一定局限性。

本研究通過(guò)ROC 曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)NGS 技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)在新生兒遺傳性聾篩查方面具有一定價(jià)值，兩種技術(shù)聯(lián)合篩查的AUC 達(dá)到0.976，靈敏度、特異度分別為95.65%、99.50%，由此可見(jiàn)，NGS技術(shù)聯(lián)合TEOAE 技術(shù)能有效提高新生兒遺傳性聾篩查效能，有助于減少誤診漏診，其原因在于聯(lián)合篩查能夠?qū)我缓Y查法進(jìn)行有效補(bǔ)充，利于提高聽(tīng)力篩查結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確性。

綜上可知，新生兒遺傳性聾篩查采用NGS 技術(shù)、TEOAE 技術(shù)，均能獲得良好篩查結(jié)果，而二者聯(lián)合能有效提高篩查效能，減少誤診漏診，具有較高推廣應(yīng)用價(jià)值。但需要注意的是，對(duì)NGS 技術(shù)、TEOAE 技術(shù)篩查有一項(xiàng)未通過(guò)的新生兒仍有可能發(fā)展為耳聾，仍需定期隨訪和復(fù)查，兩項(xiàng)均通過(guò)的新生兒仍有可能發(fā)生遲發(fā)性聽(tīng)力損失，仍需每3 年至少隨訪1次，但本研究隨訪時(shí)間較短，這是本研究的不足，未來(lái)工作中仍需進(jìn)一步完善。