柴胡疏肝散對糖尿病周圍神經病變大鼠瞬時受體電位香草酸亞型1/降鈣素基因相關肽通路及坐骨神經電生理變化的影響

王陽陽，黃霄云，馮茂勝

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一組代謝性疾病，與胰島素分泌受損或細胞對該激素作用的抵抗有關［1］。糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是DM 最復雜的病理改變之一，據估計，大約一半的DM病人存在這種情況［2-3］。因此，探究DPN 的致病機理及影響因素，對于預防嚴重的DPN 并發癥至關重要［4］。柴胡疏肝散近年來被廣泛用于治療多種病癥，可疏肝理氣、活血止痛，如2 型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）合并高脂血癥等［5］。瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor poten?tial vanlloid 1，TRPV1）可在多種物理、化學因素刺激下參與痛覺整合、抗炎、調節胃腸等生理和病理過程［6］。降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是由感覺神經元釋放的一種肽類物質，可將感覺信息傳遞給中樞系統以調節神經活動［7］。研究證實，過表達CGRP 能夠促進神經血管擴張，增加血流，改善DPN［8］。同時，TRPV1 激活后可促進CGRP 等神經遞質的釋放，具有擴張血管和利尿的作用［9］。因此本研究通過建立DPN 大鼠模型，檢測應用柴胡疏肝散治療DPN 大鼠后對TRPV1/CGRP 通路的影響，以期發現柴胡疏肝散在DPN中的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 2019年12月至2020年9月，從北京生命科學研究所動物實驗中心［合格證號為SYXK（京）2015-0002］購入40只SPF級SD雄性大鼠，體質量范圍為150~180g，飼養在適宜的溫度和濕度下。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2藥品 柴胡疏肝散：柴胡、陳皮各6 g，白芍、枳殼、川芎、香附各4.5 g，炙甘草1.5 g，由廣州致信藥業有限公司提供，藥材經冷水浸泡2 h，常規兩煎，混合煎液并過濾，經水浴蒸發濃縮成含生藥1.26 g/mL 的濃縮藥，高壓滅菌后冷藏備用。彌可保（江蘇衛材藥業有限公司，批號20190318）；鏈脲佐菌素（strep?tozotocin，STZ；美國Sigma 公司，批號20190607）；兔抗鼠TRPV1、CGRP、腫瘤壞死因子-α（tumor necro?sis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）一抗（英國Abcam 公司，貨號ab120099、ab272713、ab215188、ab197447）；HE 染色試劑盒（德國默克公司，批號G1120）；二喹啉甲酸（bicinchonin?ic acid，BCA）試劑盒（美國賽默飛公司，貨號A53225）；考馬斯亮藍試劑盒（上海康朗生物科技有限公司，貨號KL-D3297）。

1.1.3實驗設備 GIS-500 凝膠成像儀（上海艾研生物科技有限公司，貨號1708195）；肌電圖儀（丹麥丹迪醫療公司，型號Keypoint-4）；血糖儀（拜耳醫藥保健有限公司，型號拜安捷2）；CX43 光學顯微鏡（濟南歐萊博電子商務有限公司，貨號CX43）。

1.2 方法

1.2.1模型建立 隨機選取5 只大鼠為對照組（給予普通飼料喂養），其余大鼠用于造模。造模大鼠采用高脂飼喂4 周，以誘發胰島素抵抗。隨后大鼠禁食14 h，再給予小劑量STZ（25 mg/kg，溶于0.1 mol/L、pH 4.5 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，將STZ 配置為1%的溶液，經0.22 μm 的微孔濾膜過濾除菌）。對照組給予等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。3 d后從尾靜脈采血，用血糖儀測定空腹血糖（fasting blood sugar，FBG），FBG≥13.8 mmol/L，確定為DM 大鼠，用于實驗。DM 大鼠再繼續高糖高脂飼喂8 周，使用肌電圖儀對大鼠下肢坐骨神經的感覺和運動傳導速度進行檢測，若大鼠感覺或運動傳導速度減慢超過11%，則表示成功建立DPN 模型［10］。在實驗過程中有5 只大鼠死亡或造模失敗，成功建立DPN模型30只。

1.2.2分組與給藥 將DPN 模型大鼠隨機分為模型組（n=5）、彌可保組（n=5）、低中高劑量柴胡疏肝散組（每組n=5）。參考文獻［11］彌可保組按1 次/天，175 μg/kg 劑量灌胃給藥，參考文獻［12］柴胡疏肝散低中高劑量分別按照1 次/天，3.15 g/kg、6.30 g/kg、12.60 g/kg灌胃給藥，連續給藥8周。

1.2.3各組大鼠擺尾溫度閾值檢測 給藥8周后，將大鼠放置于寬松的籠內，露出尾部，用恒溫加熱儀（每分鐘加熱2 ℃），加熱水溫，水溫從20 ℃開始將鼠尾浸入水中約2 cm，鼠尾因水溫過高而擺動并露出水面時記錄水溫，此時水溫即為擺尾溫度閾值。

1.2.4各組大鼠運動神經傳導速度（MNCV）的測定 第8周末采用1%戊巴比妥鈉0.4 mL/100 g腹腔內注射麻醉，使用肌電圖儀檢測大鼠下肢MNCV，觀察MNCV 及其支配肌復合運動動作電位的波幅（AMP）、潛伏期（LAT）的變化。在腘窩下1~2 cm 處經皮插入2 個針電極（電極間距1 cm）用方波（10~15 mA，0.1 ms 脈波寬，頻率1 Hz）刺激神經，在距刺激電極2~3 cm 處的同側脛前肌記錄肌肉動作電位。兩個刺激部位間的距離用彎腳規測量，運動神經在兩個刺激部位間的傳導時間為潛伏期差，計算MNCV（距離/潛伏期差值），記錄AMP、LAT變幅。

1.2.5qRT-PCR 法檢測大鼠血清TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 水平 采用腹主動脈取血，離心分離血清，-80 ℃保存備用。Trizol 法提取總RNA，將RNA 逆轉錄合成cDNA 行qRT-PCR 擴增。反應體系（20 μL）：10 μL 2×SYBR Mix，1 μL cDNA模板，0.5 μL正向引物和0.5 μL反向引物，8 μL雙蒸水。反應條件：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min 的40 個循環，72 ℃、10 min。2-??Ct方法對mRNA 表達水平進行定量，并標準化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6HE 染色觀察大鼠坐骨神經病理學變化 解剖后取坐骨神經組織于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，切片經脫蠟、水化后，用蘇木素染色10min，滴加伊紅染液復染5 min 后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察坐骨神經組織病理變化。另切除約50 mg 大鼠坐骨神經組織，用于蛋白質印跡法檢測。

1.2.7蛋白質印跡法檢測大鼠坐骨神經中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平 取坐骨神經組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質樣品，并轉移至PVDF膜。5%脫脂奶將膜封閉2 h 后，與一抗TRPV1（1∶1 000）、CGRP（1∶1 000）、TNF-α（1∶5 000）、IL-1β（1∶2 500）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 清洗5 min×3次。加入二抗（1∶15 000）在室溫下反應2 h，ECL 顯色，凝膠成像儀觀察蛋白條帶。Image J軟件分析條帶灰度值，并以β-actin 為內參計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料均符合正態分布表示為±s，單因素方差分析和SNK-q檢驗用于三組及以上的組間比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態對照組大鼠精力充沛，活動靈活，飲食正常；模型組大鼠活動減少，毛發枯黃無光澤，呈多飲、多食、多尿癥狀；彌可保組大鼠飲食及排泄均正常，活動較多，與對照組相似；柴胡疏肝散組大鼠較模型組“三多”癥狀減輕，飲食逐漸恢復，劑量越高狀態越好。

2.2 各組大鼠擺尾溫度閾值及MNCV 的比較與對照組相比，模型組大鼠擺尾溫度閾值、LAT 升高，MNCV、AMP 降低（P<0.05）；與模型組相比，彌可保組、低中高劑量柴胡疏肝散組大鼠擺尾溫度閾值、LAT 降低，MNCV、AMP 升高（P<0.05）。與彌可保組相比，低、中劑量柴胡疏肝散組大鼠擺尾溫度閾值、LAT升高，MNCV、AMP降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠擺尾溫度閾值、MNCV、AMP、LAT的比較/± s

表2 各組大鼠擺尾溫度閾值、MNCV、AMP、LAT的比較/± s

注：MNCV為運動神經傳導速度，AMP為肌復合運動動作電位的波幅，LAT為潛伏期。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與彌可保組比，P<0.05。④與低劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。⑤與中劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。

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2.3 各組大鼠坐骨神經病理變化正常組大鼠坐骨神經纖維及髓鞘排列緊密，厚度均勻，形態結構完整。模型組大鼠神經細胞周圍觀察到大量浸潤性巨噬細胞和單核細胞，并伴有廣泛的軸突脫髓鞘。彌可保組大鼠神經內膜和髓鞘的廣泛軸突腫脹和水腫較少，中性粒細胞浸潤較少，并且沒有可觀察到的脫髓鞘。低劑量柴胡疏肝散組髓鞘腫脹，巨噬細胞周圍有單核細胞浸潤以及程度較輕的脫髓鞘。中劑量柴胡疏肝散組神經外膜周圍輕度水腫，血管周圍浸潤性中性粒細胞減少以及神經纖維僅輕微腫脹。高劑量柴胡疏肝散組神經纖維形態恢復正常，但周圍伴有少量中性粒細胞浸潤。見圖1。

2.4 各組大鼠坐骨神經組織中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1βmRNA 水平的檢測與對照組相比，模型組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 水平均升高（P<0.05）。與模型組相比，彌可保組及低中高劑量柴胡疏肝散組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 水平均降低（P<0.05）。與彌可保組相比，低、中劑量柴胡疏肝散組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA水平均升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠坐骨神經組織中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA水平的檢測/± s

表3 各組大鼠坐骨神經組織中TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA水平的檢測/± s

注：TRPV1為瞬時受體電位香草酸亞型1，CGRP為降鈣素基因相關肽，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β，GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與彌可保組比，P<0.05。④與低劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。⑤與中劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。

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2.5 各組大鼠坐骨神經組織TRPV1、CGRP、TNFα及IL-1β蛋白表達水平與對照組相比，模型組TRPV1、CGRP、TNF-α 及IL-1β 蛋白水平均升高（P<0.05）。與模型組相比，彌可保組及低中高劑量柴胡疏肝散組上述蛋白水平均降低（P<0.05）。與彌可保組相比，低、中劑量柴胡疏肝散組上述蛋白水平均升高（P<0.05）。見表4，圖2。

圖2 大鼠坐骨神經組織TRPV1、CGRP、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平

表4 各組大鼠坐骨神經組織TRPV1、CGRP、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平/± s

表4 各組大鼠坐骨神經組織TRPV1、CGRP、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平/± s

注：TRPV1為瞬時受體電位香草酸亞型1，CGRP為降鈣素基因相關肽，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β。①與對照組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。③與彌可保組比，P<0.05。④與低劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。⑤與中劑量柴胡疏肝散組比，P<0.05。

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3 討論

DM已成為全球公共衛生危機，國際糖尿病聯合會估計，2017 年全球DM 病人為4.51 億（18~99歲）［13］。隨著經濟的快速發展和工業化進程的加快，生活方式的改變和人口老齡化，我國DM的患病率持續上升。據世界衛生組織統計，2005—2015年，中國因DM及相關心血管疾病造成的經濟損失達5 577億美元［14］。DPN是DM常見的慢性并發癥，最常見的表現是伴有感覺喪失的遠端退行性多發性神經病變，約20%~30%的病人可能會出現神經性疼痛，由于疼痛、感覺喪失、步態不穩、足部潰瘍甚至截肢，很多DPN 病人生活質量嚴重下降［15］。此外，這些并發癥的發生和發展會導致視力和神經功能喪失，活動和認知能力受損，生活質量下降，如果不進行控制或治療，可能會造成不可逆的損害甚至死亡。

中醫將DPN 歸屬于“消渴”繼發的痹癥、麻木、痛癥、痿癥等范疇，是病久失治、飲食不節、情志失調、勞欲過度所致，參照《糖尿病中醫防治指南》中對DPN 的描述，可將很多DPN 病人歸于肝腎虧虛型，這類病人伴有肢體麻木、疼痛，肌肉萎縮、腰膝酸軟、頭暈耳鳴等癥狀。柴胡疏肝散包含多種中藥材，其中柴胡善疏泄肝氣而解郁，具有抗炎和鎮痛的作用。此外，香附有疏肝理氣止痛的功效；陳皮性辛、苦，可理氣健脾、燥濕化痰；川芎具有鎮痛、抗血栓、擴血管等作用［16］。張鵬翔等［17］發現柴胡疏肝散能改善DPN 病人血液流變學，抑制氧化應激反應，清除氧自由基，提高感覺和運動神經傳導速度，降低血糖。研究發現，STZ誘導的DM大鼠坐骨神經髓鞘損傷明顯，MNCV 降低［18］。本研究發現，造模后大鼠活動減少，毛發枯黃無光澤，呈多飲、多食、多尿的“三多”癥狀；與對照組相比，低中高劑量柴胡疏肝散組大鼠擺尾溫度閾值、LAT 升高，MNCV、AMP 降低。提示DM 大鼠造模成功，用藥后大鼠對熱敏度及運動神經功能均有所提高，且改善效果呈劑量依賴性。

神經肽是近年來發現的具有廣泛生物活性的神經遞質，其中CGRP 備受關注，CGRP 具有很強的生物活性，是中樞神經系統和外周神經系統的重要神經遞質。CGRP 通過偶聯G 蛋白將信號通過第二信使環磷酸腺苷傳遞到細胞中，是許多生理效應的關鍵，使其成為DM、疼痛、炎癥和其他疾病或疾病相關癥狀的發展和進展的積極參與者，但目前對CGRP 在DPN 中的作用及其機制的研究卻很少。CGRP 的釋放依賴于神經元感覺神經末梢或膜上TRPV 的存在。TRPV1是TRPV 家族的重要成員，也是與神經源性炎癥相關的重要傷害感受器［19］。另有研究發現，TRPV1 還可通過降低細胞內鈣離子濃度，下調TNF-α、IL-1β水平，從而抑制小膠質細胞炎癥反應［20］。研究顯示，小膠質細胞的炎癥反應導致坐骨神經損傷，而坐骨神經損傷則導致坐骨神經功能下降和電生理的改變，這也被視為慢性神經性疼痛的主要原因［21］。本研究發現，模型組大鼠較低中高劑量柴胡疏肝散組TRPV1、CGRP、TNF-α、IL-1β mRNA 及蛋白水平均降低。提示DPN 與TRPV1、CGRP 信號通路的異常表達及炎癥水平有關，猜測在病理狀態下，由于柴胡疏肝散抑制了TRPV1 表達，引起CGRP 及TNF-α、IL-1β 等炎性因子表達水平降低，從而減輕大鼠坐骨神經的炎癥反應，最終改善DPN癥狀。

綜上所述，柴胡疏肝散可能通過抑制TRPV1，降低CGRP 及TNF-α、IL-1β 等炎性因子表達水平，提高大鼠坐骨神經功能，達到改善DPN 的作用。但本研究也存在未檢測神經細胞凋亡相關因子等試驗，有待后續深入研究。

（本文圖1見插圖7-1）