大豆品種齊黃34 廣適性的遺傳分析

劉薇，王玉斌，李偉，張禮鳳，王彩潔，徐冉，戴海英，張彥威

(山東省農業科學院作物研究所/山東省特色作物工程實驗室，山東濟南 250100)

大豆對光周期敏感[1-3]，這一特性直接反映在開花期、成熟期等生態適應性相關性狀上。 具體表現為大豆品種在不同地區間引種會導致開花期和生育期改變，進而影響產量，嚴重時導致植株不能正常開花結實。 因此，大豆品種的適應范圍非常狹窄，極大限制了品種的推廣及產量突破。

開花期是大豆適應性的一個重要指標，對開花期調控基因的研究是大豆適應性改良的重要切入點。 目前，包括E 系列基因(E1～E11)、J基因以及Tof11/12等在內的與開花期相關的關鍵位點相繼被發現[4]。 在這些基因中，E1、E2、E3和E4基因的相互組合與大豆的開花期、生育期性狀密切相關[5-7]，其中E1對開花期及生育期的影響最大[8-11]。E1基因為豆科作物所特有，在長日下特異表達，其過量表達極顯著抑制大豆開花，是重要的開花抑制基因[12]。

齊黃34 是近年培育出的高產廣適大豆品種[13]，先后通過國家黃淮海北片和中片、山東省、江蘇省淮北和淮南區、貴州省審定，通過安徽省、河南省引種審批，是農業農村部主導品種和主推的四大核心品種之一[14]。 該品種適應范圍廣，適種范圍跨越了20 個緯度。 但是目前關于該品種的廣適性遺傳機理尚缺乏研究。

前期，我們利用齊黃34 和另一個黃淮海推廣品種冀豆17[15]為雜交親本衍生得到重組自交系群體，并基于此群體材料構建了高密度遺傳圖譜[16]。 本研究利用該群體針對開花期進行QTL 定位，以期闡明使齊黃34 適應范圍廣的QTL 位點和關鍵基因，同時為齊黃34 的遺傳改良提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為齊黃34、冀豆17 及其雜交衍生的由256 個家系成員組成的重組自交系(RIL)群體。

1.2 試驗方法

1.2.1 表型統計 重組自交系群體分別在2018和2019 年6 月種植于山東省農業科學院濟陽試驗基地，行長為3 m，株距和行距分別為10 cm 和50 cm。 試驗設3 次重復。 每行近一半的大豆植株開花時記為初花期。

齊黃34 和冀豆17 于2019 年種植于人工光照培養箱(溫度為26℃，12 h 光照/12 h 黑暗)進行短日培養，分別統計兩個品種植株的開花時間。

1.2.2 QTL 分析 使用軟件IBM SPSS 對表型數據進行統計和分析。 使用QTL IciMaping V4.2 軟件[17]，利用區間作圖法(IM-ADD)進行QTL 定位。 似然函數比值對數值(logarithm of odds，LOD)的閾值設為2.5。

1.2.3E1基因片段的克隆及序列分析 分別取齊黃34 和冀豆17 的葉片，提取RNA，并利用TAKARA 反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A，TAKARA)反轉錄。 以 E1 - F ( 5＇-ATGAGCAACCCTTCAGATGAAAG-3＇) 和 E1 - R ( 5＇-CTCCCTTATTGTTCATCTCCTC-3＇)為引物，利用KOD-FX 高保真酶(KFX-101，東洋紡生物科技有限公司)進行E1部分序列的克隆。 擴增體系:2×buffer 20 μL，2 mmol/L dNTP 8 μL，E1-F 1.5 μL，E1-R 1.5 μL，模板2 μL，KOD-FX 0.8 μL，ddH2O 4.2 μL。 擴增程序:94℃2 min；98℃30 s，53℃30 s，68℃20 s，30 個循環；68℃5 min。 擴增產物直接交由擎科生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 開花促進基因GmFT2a實時熒光定量PCR檢測 將齊黃34 和冀豆17 種植于人工氣候室，從出苗第4 天開始，每隔4 天取最上部葉片，迅速置于液氮中，帶回并保存在-80℃冰箱中備用。提取所有樣品的RNA 并反轉錄成cDNA，利用實時熒光定量PCR 試劑盒TB GreenPremix Ex Taq(RR820A，TAKARA) 進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。GmFT2a的檢測引物為qGm-FT2a-F(5＇-TGGGGGAGTAATTGGGGATG-3＇) 和qGmFT2a - R (5＇-ACCTCATGGCCGAAACTAGC-3＇)；內參基因的檢測引物為qGmActin-F(5＇-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3＇) 和 qGmActin - R( 5＇-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3＇)。 qRT -PCR 的反應體系:2×TB GreenPremix Ex Taq10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。 反應程序:95℃30 s；95℃10 s，60℃30 s，40個循環。 利用2-ΔΔCt方法[18]進行相對表達量的計算。

2 結果與分析

2.1 開花表型分析

表1 結果顯示，RIL 群體開花期存在較大差異，存在超高親和超低親現象。 2018 年RIL 群體的開花期范圍是28.0 ～57.0 d，標準誤差為7.21，峰度和偏度分別為-0.71 和0.50；2019 年RIL 群體的開花期為30.0 ～58.0 d，標準誤差為6.81，峰度和偏度分別為-0.58 和0.59。 RIL 群體兩年的開花期分布近似正態分布(圖1)，且峰度和偏度的絕對值均小于1，表明該群體可用于QTL 定位。

圖1 RIL 群體開花期表型數據頻率分布

表1 親本及RIL 群體開花期數據統計(d)

2.2 大豆開花期性狀QTL 定位及分析

利用IM-ADD 法對開花期性狀進行QTL 定位。 2018 年和2019 年均只檢測到1 個位于6 號染色體上的QTL。 兩個環境下該QTL 的LOD 值分別為26.81 和21.91，表型貢獻率分別為40.04%和33.93%。 該QTL 在兩個環境下的加性效應均為負值，表現為負遺傳效應(表2、圖2)。

圖2 不同環境下開花期相關QTL 位點

表2 大豆開花期QTL 定位結果

該QTL 區間內存在36 個基因，其中13 個基因CDS 區在雙親間存在變異(表3)。 與父本冀豆17 相比，Glyma.06G206500 在齊黃34 中發生了移碼突變，其它12 個基因均發生了非同義突變。 Uniprot 數據庫注釋信息以及基因注釋分析發現該區間內有兩個開花期調控相關基因，其中Glyma.06G205800(GmMDE06)是擬南芥AGL8的同源基因，Glyma.06G207800 是大豆生育期組主效基因E1。 Glyma.06G207800 在齊黃34 中是顯性E1基因型，而在冀豆17 中第44 位堿基是“C”，與參考基因組Williams 82 相同，為喪失了部分功能的e1-as基因型。

表3 QTL 位點中CDS 區突變基因

2.3 親本E1 基因的序列分析和開花促進基因GmFT2a 表達量的檢測

對親本齊黃34 和冀豆17 的E1部分序列進行克隆并測序發現(圖3)，齊黃34 中的E1基因編碼區第44 個核苷酸為G，與顯性E1序列完全相同；而冀豆17 的序列在第44 位堿基發生了改變，由G 變成了C，導致編碼的氨基酸發生了替換。 證實齊黃34 中E1確實是顯性基因型，而冀豆17 中為e1-as基因型。

圖3 齊黃34 和冀豆17 E1 部分序列比對

短日處理下，齊黃34 開花期極顯著晚于冀豆17(圖4A)。 齊黃34 和冀豆17 不同時期葉片中開花促進基因GmFT2a表達量的檢測結果(圖4B)顯示，冀豆17 中GmFT2a的表達量在前期高于齊黃34，且在出苗18 天達到高峰；齊黃34 中GmFT2a的積累滯后于冀豆17，在出苗22 天達到高峰，之后表達量高于冀豆17。

圖4 冀豆17 和齊黃34 開花期比較(A)和GmFT2a 表達量(B)比較

3 討論

齊黃34 是高產廣適大豆品種，在黃淮海地區、長江中下游地區以及貴州、廣西等低緯度地區均有較好的產量表現。 為挖掘齊黃34 開花期相關QTL，闡明其廣適性的遺傳機制，本研究以齊黃34 為母本，與大豆品種冀豆17 雜交構建RIL 群體，并進行了開花期性狀的QTL 定位。 由于冀豆17 開花早于齊黃34，RIL 群體在開花期表型上存在明顯的性狀分離；在2018、2019 年兩個環境中，均只檢測到了1 個QTL(qFT6)，位于6 號染色體，表型貢獻率最高達到40.04%。 值得注意的是，大豆生育期主效基因E1位于該QTL 區間內。E1基因是大豆光周期響應的核心調控因子，與開花期密切相關。 顯性E1基因過量表達將導致大豆開花明顯延遲，是十分重要的開花抑制基因。E1的變異類型主要包括e1-fs、e1-nl、e1-as和e1-b3a[11，12]，其中，e1-as基因型是E1基因的第44個堿基發生改變，使編碼蛋白的定位發生變化[12]。e1-as型植株開花及成熟早于E1基因型植株，也早于功能喪失型(e1-fs及e1-nl)植株。本研究證實E1在齊黃34 中為顯性，在冀豆17 中為e1-as基因型。 因此，E1基因可能是解釋齊黃34 和冀豆17 衍生的RIL 群體開花表型變異的關鍵基因，該基因的存在可能是使齊黃34 也適宜在除黃淮海地區以外的日照較短的低緯度地區種植的重要原因。

同時，在該區間內還存在一個開花相關基因GmMDE06(Glyma.06G205800)。 有研究表明Gm-MDE06過量表達能促進大豆開花[19]。 但目前GmMDE06基因單倍型與開花期的相關性尚未得到闡明。 本研究結果顯示，該基因在齊黃34 和冀豆17 中有一個氨基酸的差異，因此推測其可能也是造成RIL 群體表型變異的候選基因。

GmFT2a基因在大豆開花調控中起重要作用，是成花素候選基因[20-22]。 在E1過表達植株中，GmFT2a的表達量顯著下降[12]。 近期研究表明，E1直接調控GmMDE06進而影響GmFT2a的表達[19]。 本研究中，齊黃34 前期的GmFT2a表達量低于冀豆17，且積累峰值滯后于冀豆17。 可能是由于齊黃34 中顯性E1基因對GmFT2a的抑制作用更強，造成了開花促進基因表達量的降低進而顯著縮短了其開花期。

本研究在齊黃34 和冀豆17 雜交產生的RIL群體中發現qFT6 位點，也解釋了齊黃34 不適宜在高緯度地區種植的原因:主要是因為E1為顯性，在日照偏長的高緯度地區對開花促進基因GmFT2a的抑制作用更為強烈，導致齊黃34 開花過晚，甚至不能正常開花。 隨著基因編輯技術的快速發展，今后可對齊黃34 中的E1進行定向敲除，使其轉變為隱性基因型，進而創制出以齊黃34 為遺傳基礎但適宜在北方高緯度地區種植的優異大豆種質。