止痙散調控腸道菌群治療類風濕關節炎作用及安全性評價研究

王志衡　高楊　林聃　朱立忠　蘇克雷　胡春萍　葉娟　王大為

摘要：目的研究止痙散治療類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的新機制及安全性。方法本研究采用牛Ⅱ型膠原兩次免疫誘導法造小鼠關節炎（collagen induced arthritis，CIA）模型，將造模成功小鼠隨機分為正常對照組、模型組，甲氨蝶呤組和止痙散組，每日灌胃給藥，記錄小鼠體重，足爪關節的腫脹程度，并采集小鼠結腸、直腸和盲腸區段的糞便，利用二代測序方法，檢測止痙散對小鼠腸道菌群的影響，同時對各臟器進行病理檢查。利用ICR小鼠最大給藥劑量（16 g/kg）急性毒性實驗和人等效給藥量（0.18 g/kg）亞急性毒性試驗檢測ZJS安全性。結果止痙散能夠顯著緩解小鼠關節腫脹，降低關節炎評分，降低關節部位IL-6和IL-2的表達，減少破骨細胞的數量。測序結果表明，止痙散顯著降低直腸部位腸道菌群的Chao1指數和shannon指數，而在結腸、盲腸部位無明顯變化。在門水平，止痙散升高直腸、盲腸部位擬桿菌門、放線菌門豐度，降低直腸、盲腸部位厚壁菌門，大腸桿菌門，變形菌門豐度；在屬水平上，止痙散降低直腸與盲腸部位螺桿菌、毛螺菌、理研菌、另支菌屬豐度，升高乳桿菌、擬桿菌屬豐度。在止痙散急性毒性實驗過程中，與正常組相比，止痙散組的臟器病理及血生化指標無顯著性差異。結論止痙散能夠增加直腸和盲腸部位有益菌群、降低腸道有害菌，恢復腸道微生物穩態環境從而改善類風濕關節炎小鼠的癥狀，且在止痙散的用藥過程中無明顯毒副作用。

關鍵詞：止痙散；類風濕關節炎；腸道菌群

中圖分類號：R593.22文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2023）05-0084-10

Study on the Effect and Safety Evaluation of Antispasmodic Powder on Regulating

Intestinal Flora in the Treatment of Rheumatoid Arthritis

WANG Zhi-heng GAO Yang LIN Dan ZHU Li-zhong SU Ke-lei

HU Chun-ping YE Juan WANG Da-wei

（1. The Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Nanjing University

of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China;

2. Jiangsu Institute of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，China）

【Abstract】Objective： To study the new mechanism and safety of Antispasmodic Powder in the treatment of rheumatoid arthritis（RA）. Methods： The mouse model of collagen induced arthritis（CIA）was constructed by double immune induction of bovine type II collagen. The successfully constructed mice were randomly divided into normal control group，model group，methotrexate group and antispasmodic powder group. The mice were given daily intragastric administration，and the body weight and swelling degree of paw joint were recorded. The feces of colon，rectum and cecum of the mice were collected，and the effect of antispasmodic powder on intestinal microflora of the mice was detected by the second-generation sequencing method and the pathological examination of each organ was performed. The maximum dose of ICR in mice（16 g/kg）and equivalent dose in humans（0.18 g/kg）were used to test the safety of ZJS. Results： Antispasmodic powder could significantly relieve the joint swelling，reduce the arthritis score，reduce the expression of IL-6 and IL-2，and decrease the number of osteoclasts. The sequencing results showed that the Chao1 index and Shannon index of intestinal flora in the rectum were decreased significantly，but there was no significant change in the colon and cecum. At the phylum level，antispasmodic powder increased the abundance of bacteroidetes and actinomyces in the rectum and cecum，and decreased the abundance of firmicutes，escherichia coli and proteobacteria in the rectum and cecum. At the generic level，antispasmodic powder decreased the abundance of helicobacter，lachnospira，rikenella and mycobacterium in the rectum and cecum，and increased the abundance of lactobacillus and bacteroides. In the acute toxicity test of antispasmodic powder，the organ pathology and blood biochemical indexes of the antispasmodic powder group showed no significant difference compared with the normal group. Conclusion： Antispasmodic powder can increase the beneficial bacteria community in rectum and cecum，reduce the harmful bacteria in intestinal tract，restore the homeostasis environment of intestinal microorganisms，and improve the symptoms of mice with rheumatoid arthritis. In addition，antispasmodic powder has no obvious toxic and side effects during the administration.

【Key words】Antispasmodic Powder; Rheumatoid Arthritis; Intestinal Flora

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎癥及關節炎病變為主要臨床表現的自身免疫性疾病，發病時間長，損害性大，嚴重威脅患者的生命健康［1-3］。甲氨蝶呤作為RA的一線藥物，但容易引起胃腸道、骨髓抑制等副作用［4］。止痙散由全蝎和蜈蚣組成，《秘驗奇珍》中記載蟲藥止痙散治療痙攣抽搐，風濕頑痹，對于風寒濕痹久治不愈，甚至關節變形作用頗佳。我們前期研究證實止痙散通過抑制 RANKL/NF-кB 介導的破骨細胞分化，阻止膠原誘導性關節炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠關節骨破壞，治療RA［5］。但是，止痙散化學成分復雜、作用靶點多，對機制展開深入的研究，并對其用藥安全性進行評價，將為止痙散臨床應用的推廣具有重要意義。

研究表明，腸道微生物失調與膠原誘導型關節炎有關，腸道微生物群落的失調可能是觸發RA發病的關鍵環境因素并影響RA的發生與發展［6-8］。早期研究表明，腸道內的革蘭氏陰性菌分泌的某些毒素被吸收后會導致RA的發生［9］。近年來的研究表明，RA患者腸道中柯林斯菌屬大量增殖，導致腸道菌群失調。腸道菌群失調加重往往導致RA患者病情加重。同時隨著RA患者的治療，腸道菌群物種多樣性增加，腸道菌群失調部分有明顯恢復趨勢［10］。腸道菌群的失調可能引起腸道通透性增加，導致某些病原微生物及其代謝產物進入血液循環，誘發RA。腸道菌群失調可能通過導致Th17-Treg失衡或tfh細胞過度反應誘導RA的發生［11-12］。

我們前期的研究已經證明止痙散能夠有效治療RA［5］。但止痙散是否通過改善腸道菌群失調治療RA目前尚不明確，亦無相關報道。故本研究以CIA小鼠為研究對象，探討止痙散通過改善腸道菌群失調治療RA的新機制及其安全性，為止痙散的推廣應用提供新的理論依據。

1材料

1.1動物6～7周健康雄性DBA/1J小鼠，SPF級，體重（18±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證號：SCXK（蘇）2016-0010］。適應性飼養一周，期間光暗循環12 h，自由飲水，隨后采用完全隨機分組方法，分為正常組，模型組和止痙散給藥組。

1.2實驗藥物炮制全蝎（批號：20180601，生產于杭州振德中藥飲片有限公司）、炮制蜈蚣（批號：18080115，生產于鄭州瑞龍制藥股份有限公司）、甲氨蝶呤（批號：H31020644，生產于上海上藥信誼藥廠有限公司）。止痙散由全蝎和蜈蚣按照1∶1的比例組成，全蝎和蜈蚣及甲氨蝶呤購自江蘇省中西醫結合醫院中藥房。

1.3實驗試劑牛Ⅱ型膠原（Chondrex公司，20021）；完全弗氏佐劑（Chondrex公司，7023）；不完全弗式佐劑（Chondrex公司，7002）。

1.4實驗儀器低溫行星式球磨機（南京萊步科技實業有限公司，QM-DK4）；數字式肢體腫脹測量儀（IITC Life Science公司，502MR）；小動物Micro CT顯微掃描儀（Bruker公司，SkyScan 1176）；超純水系統（Millipore公司，Milli-Q Biocel）。

1.5方法

1.5.1藥物制備蜈蚣去頭足后粉碎，過80目篩，60°C過夜烘干，隨后用球磨機打磨成更細的粉末。全蝎粉碎過80目篩，60°C過夜烘干，隨后用球磨機打磨成更細的粉末。等量稱取蜈蚣與全蝎粉末，混勻后加雙蒸水溶解成濃度為6.48 mg/mL的混懸液，給藥時搖晃均勻灌胃即可。

1.5.2動物造模分組及給藥DBA/1J小鼠用牛II型膠原免疫造模法造CIA模型［14］。二次免疫后，等造模小鼠發病率達到80%左右時，隨機分組，分為正常組，模型組，甲氨蝶呤組（0.92 mg/kg，2次/周）以及止痙散組（0.18 g/kg，1次/天）［5］，每天灌胃給藥1次），每組7只。

1.5.3觀察指標觀察各組小鼠精神狀態，毛色，記錄體重，關節腫脹以及關節畸形情況，并按如下標準［5］進行評分，四肢沒有紅斑或腫脹（0分）；開始出現紅斑和輕度腫脹，并延伸至跗骨或踝關節（1分）；從踝關節開始出現紅斑和輕度腫脹（2分）；踝關節至跖關節出現紅斑和中度腫脹（3分）；踝關節、足和手指周圍紅斑和嚴重腫脹，肢體強直、變形（4分）。

1.5.4取材小鼠造模成功后，連續給藥一月，最后一次給藥后處死小鼠，取各組小鼠的足爪關節，用4%多聚甲醛固定，分別取結腸，直腸，盲腸腸段的腸道內容物。足爪關節進行Micro-CT的檢測，腸道內容物進行16S片段測序。并取小鼠心、肝、肺、腎進行病理檢測。

1.5.5腸道菌群16S片段測序及分析使用DNA試劑盒抽提基因組DNA（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），根據說明書進行抽提。將抽提的基因組DNA跑1%瓊脂糖凝膠電泳檢測按指定基因組DNA，測序V3-V4區域，合成帶有barcode的特異引物。參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合。Illumina PE250文庫構建測序，隨后進行Illumina PE250測序。將測得的結果進行數據分析。

1.5.6初步毒性評價

1.5.6.1止痙散單日最大給藥劑量對ICR小鼠的急性毒性評價急性毒性試驗中將ICR小鼠分為正常組和止痙散組，止痙散單日給藥劑量為16 g/kg（相當于人臨床給藥劑量的960倍），配置濃度為0.2 g/mL，給藥容積為0.4 mL/10 g，分2次給藥，每次間隔8 h。正常對照組給予同體積雙蒸水作為空白對照。給藥結束后持續觀察1周時間，隨后將小鼠解剖，取心肝肺腎，多聚甲醛固定后，進行組織病理學檢查及血生化檢查。

1.5.6.2止痙散人等效劑量對ICR小鼠的亞急性毒性評價止痙散人等效給藥量亞急性毒性實驗中，將普通ICR小鼠分為2組，正常組灌胃雙蒸水，止痙散組灌胃止痙散（0.18 g/kg，1次/d）。連續給藥30 d，給藥過程中，每天記錄小鼠體重。給藥結束后，分離小鼠心、肝、肺、腎等器官，4%多聚甲醛固定后，進行組織病理學檢查及血生化檢查，初步評價止痙散人等效給藥量（0.18 g/kg）對CIA小鼠的亞急性毒性。

1.6統計學方法使用GraphPad_Prism_8.0.2.2軟件進行數據分析，方差齊者多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組小鼠類風濕關節炎癥狀比較實驗整體流程見圖1a；與模型組對比，止痙散組小鼠的關節腫脹及關節骨侵蝕程度明顯減輕（圖1b）；關節評分結果顯示止痙散組的評分與正常組相比無差異但是與模型組相比有顯著降低（圖1c）；止痙散組與正常組小鼠相比體重沒有明顯差異（圖1d）。這些結果證實了止痙散對于CIA小鼠關節炎癥狀的治療作用，且在用止痙散治療類風濕關節炎的過程中對小鼠無明顯毒性（圖1e）。

2.2各組小鼠踝關節組織病理學結果在類風濕關節炎的發展過程中，許多免疫細胞和關節細胞被激活，引起炎癥［15］。為了進一步評價止痙散對于CIA小鼠的治療作用，我們對小鼠的踝關節組織進行了免疫組化檢測疾病相關炎癥因子的變化，結果表明給藥止痙散后可以降低CIA小鼠相關炎癥因子IL-2（Interleukin-2），IL-6（Interleukin-6）的變化，與正常組相比，模型組IL-2、IL-6水平顯著升高（P<0.005），與模型組相比，止痙散組IL-2（P<0.005）、IL-6（P<0.05）水平顯著降低，止痙散降低RA小鼠的炎癥反應，延緩疾病的發生發展（見圖2）。

對破骨細胞相關指標進行檢測，發現給藥后關節部位OPG和RANKL蛋白的表達水平沒有顯著性影響，但是卻減少了破骨細胞的數量（見圖3，P<0.0005）

2.3止痙散對RA小鼠腸道菌群組成的影響

2.3.1PCA分析PCA結果顯示止痙散顯著改善了直腸和盲腸部位的物種差異，但在結腸部位的改善效果并不明顯（見圖4a）。

2.3.2α多樣性分析α多樣性可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Chao1指數反映物種總數，結果顯示，在直腸中模型組的Chao1指數最高，物種總數最多，給藥后顯著降低了物種總數；Shannon指數顯示微生物的多樣性，值越大，群落多樣性越高結果顯示在直腸和盲腸中的模型組群落多樣性較高，給藥后群落多樣性降低，在直腸組中變化有顯著性差異；α多樣性結果提示腸道菌群在直腸部位的變化更顯著。（見圖4b）。

2.3.3小鼠腸道不同部位菌群組成取小鼠腸道不同部位菌群進行16S檢測，在菌群組成上可以發現，直腸，盲腸部位的腸道組成基本一致，以厚壁菌門（firmicutes）為主，擬桿菌門（bacteroidetes）次之；而在結腸部位，以厚壁菌門（firmicutes）為主，其他菌種占比很小。在腸道菌群的組成上，直腸與盲腸部位無明顯差別，但結腸部位菌群組成與其明顯不同（見圖4c）。

2.4止痙散調控RA小鼠腸道差異菌群

2.4.1基于門水平調控小鼠腸道菌群分析基于門水平菌群差異分析檢測，在門水平上，直腸部位厚壁菌門（firmicutes），大腸桿菌門（epsilonbacteraeota），變形菌門（proteobacteria）等在給藥后都比模型組相比有降低；而擬桿菌門（bacteroidetes）和放線菌門（actinobacteria）在給藥后有所升高；在盲腸中的菌群變化與直腸有所不同，盲腸中的厚壁菌門，擬桿菌門和變形菌門的變化與直腸相反；而結腸中的菌群因變化不明顯不具有討論意義，因此不做討論。結果顯示止痙散改變了小鼠腸道不同部位的菌群，但是在門水平上直腸和盲腸的菌群變化有所不同（見圖5a）。

2.4.2基于屬水平調控小鼠腸道菌群分析在屬水平上，直腸和盲腸內容物在毛螺菌（lachnospiraceae），乳桿菌（lactobacillus），螺桿菌（helicobacter），理研菌（rikenella），Alistipes，Muribaculum，Muribaculaceae等屬種上有明顯變化，其中Muribaculum，螺桿菌（helicobacter），毛螺菌（lachnospiraceae）等屬種是文獻報道的與RA疾病相關的炎癥相關微生物，給藥止痙散后，止痙散組小鼠的這些炎癥相關微生物的水平被顯著降低了，且與正常組腸道微生物差異無二；而腸道益生菌乳酸菌（lactobacillus）增加了，證明止痙散改變了腸道菌群的豐度以及菌群種類，改善了腸道微環境，對疾病產生有利影響（圖5b）。

2.5止痙散給藥過程中對ICR小鼠的毒性研究

2.5.1止痙散單日最大給藥劑量對ICR小鼠急性毒性的研究在急性毒性實驗過程中，止痙散組小鼠的體重與正常組無明顯差異，且在穩步增長（見圖6a）。檢測小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）、尿素氮（BUN）、血肌酐（CRE）的水平，并對心、肝、肺、腎部位進行組織病理檢測。結果提示，每日按16 g/kg（相當于人臨床給藥劑量的960倍）的劑量給藥對小鼠血液生化學指標及臟器病理無明顯影響（見圖6b，圖6c）。

2.5.2止痙散人等效給藥量對ICR小鼠的影響給藥期間正常組和止痙散給藥組小鼠的活動狀態正常，在給藥第3周時止痙散組小鼠體重與正常組小鼠比較，止痙散明顯延緩了小鼠體重增長，但在第四周止痙散組與正常組體重無明顯差異（見圖7a）。各小鼠的血液生化學指標及主要臟器病理檢測（心、肝、肺、腎）無明顯異常改變，說明止痙散給藥過程中對小鼠無明顯毒性（圖7b，7c）。

3討論

RA是以炎癥、滑膜增生，關節骨破壞為主要表征的自身免疫性疾病，口服西藥是目前治療RA的首選方法。但RA的治療療程長，長期服用西藥可能出現胃腸道反應、造血系統和肝腎功能損害等副作用，停藥后復發也是目前西藥治療RA的又一痛點。止痙散由全蝎和蜈蚣等比例組成，《秘驗奇珍》中記載止痙散可以治療關節痛，中風后遺癥等。我們前期證明止痙散可以緩解RA小鼠的類風濕關節炎癥狀。在本次研究中，為了確保止痙散使用過程中的安全性，我們對給藥后的CIA小鼠進行了臟器的病理學檢查，結果顯示，各臟器無明顯毒性。為了進一步研究止痙散是否有毒性，我們使用ICR小鼠進行了急性毒性實驗，在實驗結束后檢測了臟器病理以及血生化，結果顯示，給藥過程中無明顯毒性。

有研究表明細胞因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等，

通過介導多條信號通路在 RA 疾病的發生發展中發揮著重要作用，炎性因子介導的體液免疫機制是RA炎性反應的重要因素［16］。在RA的發生發展中，破骨細胞過度分化，成骨細胞被抑制，破骨細胞與成骨細胞的失衡是RA發展的關鍵因素，OPG是破骨細胞抑制因子，Trap是破骨細胞標記酶，RankL可激活破骨細胞，Runx-2 基因主要表達于成骨細胞和骨骼肌細胞中，是調控骨形成和骨骼肌功能的重要轉錄因子之一，Runx-2 參與調控成骨細胞向破骨細胞分化［17-20］。本次研究發現，止痙散可以降低CIA小鼠相關炎癥因子IL-2、IL-6的水平，減輕RA小鼠的炎癥反應。同時，給藥后關節部位OPG和RANKL蛋白的表達水平沒有顯著性影響，但破骨細胞的數量明顯減少，這與我們之前的研究結果一致［5］，止痙散可能是通過Rankl的下游通路發揮作用。

中藥大多經口給藥并經過胃腸消化吸收，這一過程有可能影響和調控體內腸道菌群，發揮腸相關淋巴組織乃至全身的免疫調節作用，這可能是其發揮藥理作用的機制之一［21］。近來研究表明，腸道微生態菌群失調是RA發生及發展的重要因素。Pedrogo D a M等提出，腸道微生態菌群失調會增加腸道上皮細胞及黏膜的通透性，損傷腸上皮細胞的保護屏障，導致腸道中某些病原微生物及其促炎代謝物進入血液循環后不斷聚集于關節處，最終引發炎癥。也有研究表明，腸道菌群失調可能通過導致Th17-Treg失衡或tfh細胞過度反應誘發RA［22-25］。另外有報道稱，隨著關節炎的發病，CIA易感小鼠的腸道菌群多樣性指數明顯高于正常小鼠［26］。本次研究結果顯示，直腸區域模型組Chao1指數和Shannon指數較高，物種總數多，群落多樣性高，止痙散能顯著降低直腸部位腸道菌群的物種總數和群落多樣性。結腸的Chao1指數比直腸和盲腸腸段低，且菌群的分析結果也顯示在門和屬的水平上結腸的差異菌群種類較少，沒有代表意義，因此不再討論結腸菌群的變化水平。擬桿菌門具有維持腸道菌群平衡的作用［27］，在給藥止痙散后，直腸部位擬桿菌（bacteroidetes）的水平升高，有助于恢復腸道菌群的平衡狀態；盲腸部位擬桿菌（bacteroidetes）的水平與其相反，產生差異的原因需要進行深入探討。

研究表明，某些致病菌會加重RA的反應，同時，隨著RA的發展，腸道中的某些菌群的相對豐度也會發生改變。Ebrahimi等［28］發現感染H.pylori（螺桿菌屬）的RA患者的C反應蛋白等指標的檢測水平、DAS-28和VAS評分明顯高于未感染H.pylori的RA患者。同時，研究人員通過宏基因組測序技術發現［29］，隨著RA患者病情加重，RA患者腸道中擬桿菌屬（muribaculaceae）顯著減少，毛螺菌（lachnospiraceae）、螺桿菌（helicobacter）顯著增加。本研究中，CIA小鼠直腸和盲腸部分的毛螺菌和螺桿菌的相對豐度升高，擬桿菌屬的相對豐度降低，止痙散給藥后，上述菌群的改變被逆轉并恢復至與正常水平接近。大量的研究表明口服乳桿菌等益生菌，能夠緩解類風濕性關節炎的炎癥反應［9］。本研究中，給予0.18 g/kg止痙散后，小鼠直腸和盲腸部位乳桿菌（lactobacillus）的水平明顯升高，并高于正常組。因此，我們認為止痙散可能通過改善腸道菌群失調、提高益生菌豐度降低RA炎癥反應，阻止RA進一步發展。

基于此，本研究從腸道菌群出發，研究止痙散對CIA小鼠腸道菌群的變化的影響，并從小鼠腸道的不同部位出發，闡明止痙散治療RA的作用機制（見圖8）。

4結論

止痙散是《秘驗奇珍》中的驗方，由全蝎和蜈蚣兩味蟲類藥組成，全蝎和蜈蚣都屬于走竄類中藥，全蝎活絡止痛，攻毒散結，用于治療關節痹痛功效較佳；蜈蚣為熄風止痙要藥，對于治驚癇抽搐，破傷風等癥均有良效［30］。

本研究在動物實驗中使用牛Ⅱ型膠原誘導的CIA小鼠進行造模給藥，給藥之后發現止痙散組與正常組相比體重無明顯差異；CIA小鼠的關節腫脹及關節畸形情況與模型組相比顯著減輕；且給藥組的炎癥因子的水平顯著降低，止痙散組的破骨細胞及成骨細胞相關因子都有改善，從而改善RA的關鍵癥狀。

此外，在給藥之后，止痙散組的腸道菌群的豐度與模型組相比也有差異。在用16SrRNA進行腸道內容物測序之后，發現其菌群在直腸與盲腸部位發生顯著變化，如文獻報道的炎癥相關微生物螺桿菌（helicobacter），毛螺菌（lachnospiraceae）等在給藥治療之后其豐度顯著降低了，而乳酸菌（lactobacillus）的含量升高了，證明止痙散給藥降低了全身炎癥反應，提高了益生菌的含量，對RA產生治療作用，且在治療過程中無明顯毒副作用。但是，本次實驗納入樣本量較小，后期研究將進一步擴大樣本、結合代謝組學對止痙散改善腸道菌群治療RA的機制做更深入的探討。

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