指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)馬鞭草質(zhì)量的方法學(xué)研究

王 諍,劉松照,劉叢彬,王國(guó)凱,3,謝冬梅,3,4*

(1.寧國(guó)市市場(chǎng)監(jiān)督管理局,安徽 寧國(guó) 242300;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;3.中藥研究與開(kāi)發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012;4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所,安徽 合肥 230012)

馬鞭草(Verbenae Herba)為馬鞭草科(Verbenaceae)植物馬鞭草的干燥地上部分,始載于《名醫(yī)別錄》,原產(chǎn)于熱帶美洲[1],其味苦、性涼,具有活血散瘀、利水退黃、解毒、截瘧的功效[2-3]。馬鞭草中主要指標(biāo)性成分包括環(huán)烯醚萜苷類(lèi)的馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷以及苯丙素類(lèi)的毛蕊花糖苷[4-6]。目前有關(guān)馬鞭草環(huán)烯醚萜苷類(lèi)及苯丙素苷類(lèi)成分含量測(cè)定的報(bào)道較少,難以全面控制并評(píng)價(jià)馬鞭草藥材的質(zhì)量。中藥指紋圖譜能夠較全面地反映中藥的質(zhì)量特性,近年來(lái)常被用于中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)[7]。本研究通過(guò)建立馬鞭草的指紋圖譜,結(jié)合主成分分析、聚類(lèi)分析等方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,旨在為馬鞭草的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)理論依據(jù)。同時(shí)由于多指標(biāo)成分的含量測(cè)定中對(duì)照品的需求較高,本研究建立了馬鞭草中3種指標(biāo)性成分的一測(cè)多評(píng)法[8],并與外標(biāo)法進(jìn)行比較,證明所建立的方法簡(jiǎn)便、可靠,可節(jié)省大量對(duì)照品[9],提高檢測(cè)效率,現(xiàn)將研究過(guò)程報(bào)道如下。

1 儀器及材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀(LC-10ATVP泵,SPD-10AVP紫外檢測(cè)器,SIL-10ADVP自動(dòng)進(jìn)樣器,LC-Solution色譜工作站,日本島津),Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),十萬(wàn)分之一電子天平AB135-S(瑞士梅特勒托利多)。

1.2 材料

甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水;馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品均由本實(shí)驗(yàn)室自制,純度均達(dá)98%以上。不同來(lái)源的馬鞭草藥材16 批,見(jiàn)表1。

表1 馬鞭草樣品16批的產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷對(duì)照品7.16、11.62、15.47mg,置于10mL容量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻;取1mL對(duì)照品溶液置于10mL容量瓶中,加80%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1mL含0.071 6mg戟葉馬鞭草苷、0.116 2mg馬鞭草苷和0.154 7mg毛蕊花糖苷的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 供試品溶液制備

取藥材粉碎過(guò)80目篩,取粉末約0.5g,精密稱(chēng)定,加80%甲醇25mL,置具塞錐形瓶中,稱(chēng)定重量,超聲(功率100W,頻率40kHz)提取30min,冷卻至室溫。80%甲醇補(bǔ)足重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm,柱溫30℃;流動(dòng)相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),體積流量1mL/min,進(jìn)樣量10μL,洗脫程序見(jiàn)表2。在上述色譜條件下,戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷色譜峰分離效果較好,見(jiàn)圖1。

注:1.戟葉馬鞭草苷;2.馬鞭草苷;3.毛蕊花苷。

表2 梯度洗脫程序

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品,按上述方法制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,以2號(hào)色譜峰(馬鞭草苷)的保留時(shí)間和峰面積作為參考,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果其RSD值均<1.5%,6次采集的指紋圖譜的相似度>0.98,表明該儀器和所用方法的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品,按上述方法制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,分別于0、2、4、6、8、10、12h檢測(cè),以2號(hào)色譜峰(馬鞭草苷)為參照峰,測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,并計(jì)算RSD值。結(jié)果表明,RSD均<1.5%,且6次采集的指紋圖譜的相似度>0.97,表明該儀器和所用方法的穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品6份,按上述方法制備6份供試品溶液,并按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以2號(hào)色譜峰(馬鞭草苷)為參照峰,測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,并計(jì)算RSD值。結(jié)果表明,RSD均<1.5%,且6次采集的指紋圖譜的相似度>0.97,表明該儀器和所用方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 特征指紋圖譜的建立 應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)16批馬鞭草藥材的色譜進(jìn)行分析,色譜見(jiàn)圖2,相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。共確定11個(gè)共有峰,其中1號(hào)峰為戟葉馬鞭草苷、2號(hào)峰為馬鞭草苷、6號(hào)峰為毛蕊花苷。經(jīng)分析可知,11個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD均<1%,峰面積RSD值在18.33%～81.22%之間。結(jié)果顯示不同批次的馬鞭草化學(xué)成分種類(lèi)相似,但部分成分的含量存在較大差異,見(jiàn)表4、表5。

圖2 馬鞭草16批的指紋圖譜

表3 相似度計(jì)算結(jié)果

表4 馬鞭草共有峰的保留時(shí)間 (min)

表5 馬鞭草共有峰的峰面積

2.4.5 特征指紋圖譜的結(jié)果分析 應(yīng)用SPSS 23.0分析軟件對(duì)16批馬鞭草進(jìn)行主成分分析(表6、表7、圖3),以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn),選取前3個(gè)作為主成分,其方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)到84.233%。第一主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率均大于第二主成分,說(shuō)明第一主成分包含信息最多。由旋轉(zhuǎn)前后因子載荷矩陣可知,1號(hào)色譜峰、2號(hào)色譜峰和6號(hào)色譜峰在第一成分中有明顯的正相負(fù)荷,表明戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花苷可作為馬鞭草的指標(biāo)性成分,反映樣品特性。

圖3 樣品主成分三維得分

表6 旋轉(zhuǎn)前后的特征值及方差貢獻(xiàn)率

表7 因子載荷矩陣

將16批馬鞭草樣品特征圖譜中11個(gè)共有峰的峰面積經(jīng)均一化數(shù)據(jù)處理后作為變量,應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,采用中位數(shù)聚類(lèi)法,區(qū)間選取平方Euclidean距離,進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖4)。當(dāng)類(lèi)間距為10時(shí),16批藥材可分為兩大類(lèi),S3、S8、S9和S10分為一類(lèi),其余分為一類(lèi),與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果較為一致。

圖4 聚類(lèi)分析結(jié)果

2.5 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

2.5.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 配制一系列含有戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的混合對(duì)照品溶液,按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定,以進(jìn)樣濃度和峰面積分別為橫、縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):Y=1.0×106X+925.81,r=0.999 8;Y=1.0×106X+18 654,r=0.999 6;Y=956 465X+28 464,r=0.999 5。結(jié)果表明,戟葉馬鞭草苷在0.143～3.580μg、馬鞭草苷在0.232～5.810μg、毛蕊花糖苷在0.309～7.735μg范圍內(nèi)的進(jìn)樣量,與峰面積呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5.2 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)。取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得峰面積,并計(jì)算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,3種成分的RSD值分別為1.03%、1.23%和1.16%,表明所用方法的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12h檢測(cè),測(cè)得峰面積,并計(jì)算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,供試品溶液中3種成分的RSD值分別為1.00%、0.63%和1.11%,表明所用方法的穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)。取藥材(S3)粉末約0.5g,精密稱(chēng)定,按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,并按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和RSD值,供試品溶液中3種成分的RSD值分別為1.70%、1.12%和1.71%,表明所用方法的重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)。稱(chēng)取同一藥材(S11)粉末6份,每份約0.1g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,分別加入戟葉馬鞭草苷(0.628mg/mL)、馬鞭草苷(0.828mg/mL)及毛蕊花糖苷(0.518mg/mL)3種對(duì)照品溶液1mL,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算樣品中戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷和毛蕊花糖苷的含量和測(cè)定量,3種指標(biāo)性成分平均回收率分別為97.83%、98.67%和97.76%,其RSD值分別為0.89%、0.87%和1.18%,見(jiàn)表8。

表8 3種指標(biāo)性成分的加樣回收率 (n=6)

2.5.3 含量測(cè)定 取藥材粉末0.5g,精密稱(chēng)定,依照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定,按外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量,結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果 (%)

不同批次馬鞭草藥材中戟葉馬鞭草苷含量在0.32%～0.63%,馬鞭草苷含量在0.25%～1.89%,毛蕊花糖苷含量在0.26%～2.40%。研究結(jié)果表明,不同產(chǎn)地不同批次馬鞭草藥材中各成分含量差異明顯。

2.6 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定藥材中3種指標(biāo)性成分的含量

2.6.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 在線(xiàn)性范圍內(nèi),各成分的量與峰面積成正比關(guān)系,即W=fA,相對(duì)校正因子f(k/m)=fk/fm=(Wm×Ak)/(Wk×Am),其中Ak為內(nèi)參物峰面積,Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度,Am為組分m的峰面積,Wm為組分m的質(zhì)量或濃度。以馬鞭草苷為內(nèi)參物,測(cè)定結(jié)果計(jì)算得f馬鞭草苷/戟葉馬鞭草苷=1.11,f馬鞭草苷/毛蕊花糖苷=1.46,RSD分別為0.88%、2.68%,見(jiàn)表10。

表10 3種成分的相對(duì)校正因子

2.6.2 相對(duì)校正因子重復(fù)性考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、10、20、50μL,在確定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得f馬鞭草苷/戟葉馬鞭草苷=1.15,f馬鞭草苷/毛蕊花糖苷=1.44,RSD分別為2.69%、1.10%,結(jié)果顯示,各成分的f值重復(fù)性良好。

2.6.3 不同色譜儀和色譜柱考察 取對(duì)照品溶液,選擇Shimadzu LC-10A型和Agilent 1200型高效液相色譜儀,選定色譜柱Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm)、Kromasil C18(250mm×4.6mm,5μm)進(jìn)行色譜分析,計(jì)算f值。結(jié)果表明,不同高效液相和色譜柱對(duì)馬鞭草3種指標(biāo)性成分f值的影響無(wú)明顯差異,見(jiàn)表11。

表11 儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.6.4 不同流速考察 同等色譜條件下,分別設(shè)定流速為0.8、0.9、1.0mL/min,取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算f值,RSD分別為0.53%、0.40%。表明流速對(duì)各成分f值的影響無(wú)明顯差異。

2.6.5 不同柱溫考察 在同等色譜條件下,分別設(shè)定柱溫為25、30、35℃,取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算f值,結(jié)果RSD為0.92%、0.40%。表明柱溫對(duì)各成分f值的影響無(wú)明顯差異。

2.6.6 待測(cè)成分色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn) 以馬鞭草苷為內(nèi)參物,定位標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為保留時(shí)間差和相對(duì)保留值。由表10、表11 結(jié)果可知,保留時(shí)間差波動(dòng)較大,RSD>2%。相對(duì)保留值波動(dòng)較小,RSD均<2%,無(wú)明顯差異。因此,選擇相對(duì)保留值作為最終定位標(biāo)準(zhǔn),見(jiàn)表12。

表12 相對(duì)保留值考察結(jié)果

2.7 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的比較

取藥材粉末0.5g,制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算各成分的含量。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對(duì)馬鞭草苷的保留時(shí)間相對(duì)校正因子平均值分別為0.75、0.80。因此戟葉馬鞭草苷保留時(shí)間T1=0.75×ts,毛蕊花糖苷保留時(shí)間T2=0.80×ts,其中ts為馬鞭草苷的保留時(shí)間。戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對(duì)馬鞭草苷的相對(duì)校正因子為1.11和1.22。根據(jù)研究結(jié)果得出含量計(jì)算公式:

戟葉馬鞭草苷:lgCi=1.11×(lgCs×lgAi)/lgAs

毛蕊花糖苷:lgCi=1.22×(lgCs×lgAii)/lgAs

其中As為內(nèi)標(biāo)物馬鞭草苷的峰面積,Cs為內(nèi)標(biāo)物馬鞭草苷的濃度,Ai和Aii分別為戟葉馬鞭草苷、毛蕊花糖苷的實(shí)測(cè)峰面積。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表13。

表13 外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定3種指標(biāo)性成分的含量 (%)

3 討論

建立馬鞭草指紋圖譜與主成分分析、聚類(lèi)分析相結(jié)合的方法,可合理評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量,為建立科學(xué)的馬鞭草藥材質(zhì)量控制方法提供依據(jù)[10]。

一測(cè)多評(píng)法可作為中藥飲片、配方顆粒、中成藥等中藥制劑質(zhì)量控制的有效手段[11]。本研究首次將一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用于馬鞭草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系中,具有快速、簡(jiǎn)便、低成本等優(yōu)點(diǎn),可有效應(yīng)對(duì)大量分離純化難度較高的化學(xué)對(duì)照品稀缺以及價(jià)格昂貴的局面,并提高檢測(cè)效率,對(duì)馬鞭草藥材的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的完善具有重大意義,也將進(jìn)一步推動(dòng)一測(cè)多評(píng)法在藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

本研究通過(guò)建立馬鞭草指紋圖譜,同時(shí)運(yùn)用一測(cè)多評(píng)法對(duì)16批馬鞭草中3種指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定,不同批次間戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷的含量差異不大。兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異,相對(duì)校正因子重復(fù)性良好。通過(guò)馬鞭草苷可實(shí)現(xiàn)對(duì)其余兩種指標(biāo)性成分的定量分析,方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確,并且能節(jié)省大量對(duì)照品,經(jīng)濟(jì)實(shí)用,具有一定的推廣價(jià)值。