外感止咳露質量標準提升研究

李雋永,謝金利,邱瓊華,毛桂福,張新林,韋 倩,梁學政*

(1.柳州市中醫醫院/柳州市壯醫醫院 藥學部,廣西 柳州 545001;2.柳州市中藥(壯瑤藥)制劑研發重點實驗室,廣西 柳州 545001;3.柳州市中藥(壯瑤藥)制劑開發工程技術研究中心,廣西 柳州 545001;4.柳州市質量檢驗檢測研究中心,廣西 柳州 545001)

外感止咳露是我院常用的醫院制劑,由防風、前胡、桔梗、苦杏仁、甘草、荊芥、薄荷等多味藥材組成,具有疏風清熱、止咳化痰的功效,臨床上常用于風熱咳嗽、咳痰、頭痛、咽痛等,療效較好,廣泛用于本院及醫聯體單位,使用量大。由于該制劑已有20多年歷史,初申報時質量標準簡單,鑒別項為簡單的理化鑒別,缺乏專屬性,同時也缺乏含量測定項目,難以滿足當下日益嚴格的藥品監管和生產質量監控要求。為保證患者用藥的安全、有效,使產品質量有據可依,需要對其質量標準進行提升。本研究通過對外感止咳露中防風、前胡、薄荷進行薄層色譜(TLC)鑒別;以甘草酸為參照,建立了5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷和甘草酸含量測定的HPLC“一測多評”法[1-3],旨在達到全面控制產品質量的目的,為提高外感止咳露的質量標準提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

紫外分析儀(齊威儀器有限公司)、超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)、高效液相色譜儀(日本島津,LC-20AT[SPD-M20A])、高效液相色譜儀(日本島津,LC-20AT[SPD-20A])、e2695高效液相色譜儀(Waters)、紫外可見分光光度計(島津,UV-2450)、電子分析天平(瑞士梅特勒,XS205DU)、電子分析天平(瑞士梅特勒,AE200)、超純水器(普析,GWB-2E)。

1.2 藥品與試劑

薄荷腦(批號110728-201707)、白花前胡甲素(批號200113),購于中國食品藥品檢定研究院;升麻素苷(批號MUST-20022711,含量:98.42%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號MUST-20050410,含量99.91%)、甘草酸(批號MUST-20042407,含量:99.50%),購于成都曼斯特有限公司;薄層板(青島海洋化工有限公司);乙腈、甲醇為色譜純(弗頓);外感止咳露(每瓶裝250mL,批號20200201、20201101、20201201、20210102、20210103、20210201),由柳州市中醫醫院(柳州市壯醫醫院)制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 防風 取外感止咳露50mL濃縮至20mL,加正丁醇20mL萃取2次。正丁醇液合并蒸干,加乙醇1mL制成供試品溶液[4-5]。用乙醇溶解升麻素苷對照品,制成1mg·mL-1的對照品溶液。按外感止咳露處方工藝,制備成缺防風的陰性試樣,按上述樣品處理方法同法處理制成陰性對照溶液。取供試品溶液4μL、升麻素苷對照品溶液2μL、陰性對照溶液4μL點于硅膠薄層板GF254,展開劑為三氯甲烷-甲醇(8∶2),最后在紫外燈254nm下檢視。供試品色譜與對照品色譜在相同位置上顯同樣的藍紫色熒光斑點,陰性未見干擾。見圖1。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.升麻素苷對照品(批號MUST-20022711);5.缺防風陰性樣品。

2.1.2 前胡 取外感止咳露30mL以乙酸乙酯50mL萃取,萃取液蒸干后加甲醇1mL制成供試品溶液[6]。用甲醇溶解白花前胡甲素對照品,制成1mg·mL-1的對照品溶液。按外感止咳露處方工藝,制備成缺前胡的陰性試樣,按上述樣品處理方法同法處理,制成陰性對照溶液。取供試品溶液10μL、對照品溶液2μL、陰性對照溶液10μL點于硅膠G薄層板,展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮(10∶1∶1),最后噴以20%高氯酸乙醇溶液,熱風吹干后在紫外燈365nm下檢視。供試品色譜與對照品色譜在相同位置上顯同樣的熒光斑點,陰性未見干擾。見圖2。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.白花前胡甲素對照品(批號200113);5.缺前胡陰性樣品。

2.1.3 薄荷 取外感止咳露250mL,提取揮發油,取提取出的油水混合物,用石油醚(60～90℃)20mL萃取2次,石油醚液合并自然揮干至1mL,制成供試品溶液[7]。用石油醚(60～90℃)溶解薄荷腦對照品,制成2mg·mL-1的對照品溶液。按外感止咳露處方工藝,制備成缺薄荷的陰性試樣,按上述樣品處理方法同法處理,制成陰性對照溶液。取供試品溶液5μL、對照品溶液8μL、陰性對照溶液5μL點于硅膠G薄層板,展開劑為環己烷-乙酸乙酯(10∶3),最后噴以1%香草醛硫酸溶液-乙醇(1∶4)的混合液,在105℃加熱至斑點清晰。供試品色譜與對照品色譜在相同的位置上顯同樣顏色的斑點,陰性未見干擾。見圖3。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.薄荷腦對照品(批號110728-201707);5.缺薄荷陰性樣品。

2.2 HPLC一測多評法測定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸的含量

2.2.1 色譜條件 Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脫:0～15min,15%(A);15～20min,15%～20%(A);20～30min,20%～30%(A);30～35min,25%～30%(A);35～40min,30%～42%(A);40～50min,42%(A);50～55min,42%～15%(A);55～60min,15%(A);體積流量1mL·min-1;測定波長為254nm;柱溫30℃;進樣量10μL。

2.2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸對照品適量,以甲醇溶解并定容,即得混合對照溶液(5-O-甲基維斯阿米醇苷107.0μg·mL-1、升麻素苷123.5μg·mL-1、甘草酸263.4μg·mL-1)。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取供試品溶液5mL至50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,過濾即得。

2.2.4 陰性對照溶液制備 按外感止咳露處方工藝制成缺防風和缺甘草的陰性試樣;按“2.1.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 系統適應性與專屬性考察 取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL,進樣分析,結果見圖4。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的分離度均>1.5,各色譜峰的理論塔板數均在10 000以上。陰性對照無干擾,說明所用方法專屬性良好。

注:1.升麻素苷;2.5-O-甲基維斯阿米醇苷;3.甘草酸。1.prim-O-glucosylcimifugin;2.5-O-methylvisammioside;3.glycyrrhizic acid。

2.2.6 線性關系、檢測限與定量限考察 將混合對照品溶液制成6個不同濃度的系列標準對照品溶液,進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y),對照品質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X),進行線性回歸。分別取3種對照品溶液逐步稀釋進樣,以S/N=3時的濃度為檢測限,以S/N=10時的濃度作為定量限。見表1。

表1 3種成分的線性關系

2.2.7 精密度試驗 吸取供試品溶液(批號20210201),進樣6次,記錄峰面積。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.96%、0.46%、1.31%,表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 吸取供試品溶液(批號20210201),間隔0、4、8、12、24、36h 進樣,記錄峰面積。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.11%、0.10%、0.19%,表明穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗 取同一批樣品(批號20210201),分別制成6份供試品溶液,進樣。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸含量的RSD分別為1.26%、1.67%、0.29%。

2.2.10 加樣回收率試驗 取樣品(批號20210201)溶液9份,每份2.5mL,分成3組,每組3份,分別添加5-O-甲基維斯阿米醇苷70.62μg·mL-1、升麻素苷148.20μg·mL-1、甘草酸237.20μg·mL-1的混合對照品溶液2.0、2.5、3.0mL,按照“2.1.3”項下方法制備成供試品溶液,進樣測定,并分別計算回收率。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的回收率分別為100.7%、97.3%、103.2%,RSD分別為2.68%、2.63%、1.37%,表明試驗回收率良好。

2.2.11 相對校正因子(fk/s)的計算 采用多點校正法,最終fk/s以6個不同質量濃度點的fk/s平均值確定。

計算公式為fk/s=(Cs×Ak)/(Ck×As)

Ck′=(Cs×Ak′)/(fk/s×As)

Cs:參照物質量濃度

As:參照物峰面積

Ck:其他對照成分質量濃度

Ak:其他對照成分峰面積

Ak′:待測成分峰面積

得出甘草酸與5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷相對的fk/s。結果見表2。升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的fk/s分別為3.229、3.286,RSD分別為0.18%、0.09%。

表2 以甘草酸為參照的fk/s(多點校正法)

2.2.12fk/s的重現性考察 本研究考察了3套色譜系統(LC-20AT(SPD-M20A)、LC-20AT(SPD-20A)、Waters e2695)和4根不同色譜柱(Welch Ultimate AQ-C18、Orca C8、Welchrom-C18、Agilent-C18)對fk/s的影響,結果見表3。顯示不同儀器和不同色譜柱對升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的fk/s影響較小,說明該fk/s有良好的重現性。

表3 不同儀器和不同色譜柱下的fk/s

2.2.13 待測組分色譜峰的定位 以甘草酸為基準峰,計算5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷在不同色譜柱和不同儀器下的相對保留時間,結果見表4。表4顯示不同色譜柱和不同儀器下的各色譜峰相對保留時間變化較小,RSD均<3.0%,表明本方法利用甘草酸來定位升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的色譜峰,具有可行性。

表4 不同色譜柱和不同儀器下的各色譜峰相對保留時間

2.2.14 一測多評法與外標法測定結果比較 分別用外標法和一測多評法進樣測定,計算其含量,結果見表5。結果顯示,使用外標法和一測多評法測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量,其結果差異較小,RSD均<2.0%,即以甘草酸為參照,使用一測多評法測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的方法,具有可行性,且準確度較高。

表5 外感止咳露中3種成分不同方法定量測定結果 (RSD<3%)

3 討論

3.1 TLC鑒別

外感止咳露配制工藝中,對薄荷、荊芥的揮發油進行了單獨提取,揮發油是外感止咳露疏散風熱、利咽止咳的重要起效物質[8-9],其含有的薄荷腦能發揮清涼鎮咳、抗病毒等作用。通過文獻研究發現,薄荷和荊芥之間并不存在陰性干擾[10],因此選擇薄荷中的薄荷腦作為一個鑒別指標。防風具有解熱、鎮痛、抗炎作用[11];前胡具有祛痰、鎮咳、平喘等作用[12],兩者均為外感止咳露中的君藥,故選擇薄荷、防風、前胡作為TLC鑒別項,具有代表性。

本研究對各TLC鑒別均進行了系統耐用性考察,考察了不同廠家的薄層板(自制薄層板、青島海洋薄層板)、不同點樣量、不同點樣方式(圓點狀、條狀)、不同溫度(4℃、25℃)、不同濕度(32%、60%、88%)。結果顯示,各TLC鑒別在各條件下斑點清晰,各陰性對照均未出現干擾。

3.2 含量測定

本研究采用HPLC一測多評法測定5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的含量,將水、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙醚作為提取溶劑進行考察。結果顯示,三氯甲烷、乙醚提取效率最差,水、甲醇和乙醇提取效果差異不大,為節約成本,故選擇以水為溶劑。采用190～400nm進行全波長掃描,結果顯示,5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素苷在254nm處有最大吸收峰,甘草酸在254nm處吸收峰也較大,故選定254nm作為檢測波長。在流動相的選擇上,考察了乙腈-水體系和甲醇-水體系等不同流動相對供試品的分離效果,結果顯示,使用乙腈-0.05%磷酸水溶液進行梯度洗脫,各成分分離效果好,且洗脫出的成分多。

本研究選取君藥防風中的5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷作為指標成分,這是因為現代藥理學研究顯示,防風中的5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷具有顯著的解熱、鎮痛、抗炎、抗菌、調節身體免疫功能等作用[13-14],是本制劑發揮療效的主要成分,而甘草中的甘草酸具有的抗炎、抗病毒[15-16]等作用,也與制劑功效息息相關,故選擇此三者作為該制劑的指標成分。一測多評法的使用,使多個成分檢測化繁為簡,節約了檢驗成本。本研究以甘草酸作為參照物,建立一測多評法測定各成分含量,所測結果與外標法測定結果具有較高的一致性,可信度高,說明可以運用一測多評法測定該制劑中3個有效成分的含量。

本研究通過TLC法和HPLC一測多評法建立了外感止咳露的質量標準,有助于較全面地監控制劑質量。