基于HPLC測定五味通栓口服液中黃芪甲苷含量的方法學(xué)研究

張苗露,董平原,孫延紅,熊 彪,張春鳳

(1.中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院,江蘇 南京 211198;2.江西地康藥業(yè)有限公司,江西 贛州 342200)

五味通栓口服液收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-370(Z-049)-2003(Z),由黃芪、水蛭、川芎、當(dāng)歸、丹參五味中藥制成,具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效,主治腦梗(急性期)中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)氣虛血瘀證[1]。五味通栓口服液處方是依據(jù)清代王清任著作《醫(yī)林改錯(cuò)》中“治病之要訣,在于明白氣血”“元?dú)饧忍?必不能達(dá)于血管,血管無氣,必停留內(nèi)瘀”等理論[2],對(duì)補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行化裁,在多年臨床實(shí)踐中發(fā)明的協(xié)定處方。氣虛鼓動(dòng)無力,令血瘀脈絡(luò)而成中經(jīng)絡(luò)之證,若氣不充,血終難暢,其治必以益氣為先,以率血行,故以黃芪為君藥[3],其味甘性溫,歸經(jīng)入脾,補(bǔ)中益氣,《本草求真》認(rèn)為黃芪入肺補(bǔ)氣,入表實(shí)衛(wèi),為補(bǔ)氣諸藥之最[4]。因此,黃芪為本處方補(bǔ)氣逐瘀的立方基礎(chǔ)。

黃芪的化學(xué)成分眾多,主要有皂苷類、黃酮類、多糖類及多肽、氨基酸類[5]。三萜及甾體皂苷是黃芪重要的次生代謝產(chǎn)物,骨架主要為黃芪醇型和齊墩果烷型,主要包括黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、黃芪甲苷(黃芪皂苷Ⅳ)、異黃芪皂苷Ⅰ、大豆皂苷Ⅰ、胡蘿卜苷等[6],具有抑制一氧化氮釋放、降低甘油三酯水平、促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖、免疫調(diào)節(jié)等活性[7-8]。黃芪甲苷常作為黃芪藥材和含黃芪的中藥制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。《中華人民共和國藥典》2020版黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定項(xiàng)下,使用含氨試液的甲醇溶液提取黃芪藥材[9],可除去黃酮類、酚酸類物質(zhì),并使黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ、乙酰黃芪皂苷Ⅰ等其他皂苷類轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷[10],因此該方法測得黃芪甲苷含量包含了藥材中原始含量與轉(zhuǎn)化量[11]。不同堿處理方法和處理時(shí)間會(huì)影響黃芪甲苷的得率[12]。

黃芪甲苷為黃芪藥材中指標(biāo)有效成分,建立一種快捷、準(zhǔn)確的黃芪甲苷含量測定方法對(duì)五味通栓口服液質(zhì)量控制的意義重大。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中使用薄層掃描法測定黃芪甲苷含量,該方法容易受人為因素及環(huán)境因素的干擾,且重復(fù)性、準(zhǔn)確性不高。本研究建立了高效液相色譜法測定黃芪甲苷含量的方法,并與薄層掃描法進(jìn)行了對(duì)比。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BT125D十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);BSA323S千分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);HHS-21-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);KH-3000Plus型薄層色譜掃描儀(上海科哲生化科技有限公司);Series Ⅲ型高效液相色譜儀,蒸發(fā)光散射檢測器(美國Lab Allience)。

1.2 材料

黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):110781-201717,純度96.9%);正丁醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200815);氫氧化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20180308);氯仿(萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠,批號(hào):201807 05);硫酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20170708);95%乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200408);甲醇(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20201111);乙腈(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200831);硅膠G薄層板(青島海洋化工廠);Venusil XBP-C18(L)色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)(Agela Technologies,批號(hào):VX952505-L);ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm)(Agilent,批號(hào):883975-902);五味通栓口服液(山東勝利藥業(yè)有限公司,批號(hào):201001)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層掃描法測定黃芪甲苷含量

2.1.1 溶液的配制 (1)對(duì)照品溶液的配制:精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品9.280mg、12.050mg,分別加入甲醇溶解并定容至10mL,制成濃度為0.928mg/mL、1.205mg/mL的對(duì)照品溶液。

(2)供試品溶液的制備:精密量取五味通栓口服液20mL,置分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取4次,每次20mL。合并正丁醇提取液,用2%氫氧化鈉溶液洗滌2次,每次20mL,棄去堿液。用正丁醇飽和的水30mL洗滌1次,棄去水液。收集正丁醇層,置水浴鍋蒸干,殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,即得。平行制備2份。

2.1.2 測定方法及標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定 薄層板:硅膠G板(20cm×10cm)。使用前110℃活化30min,點(diǎn)樣量及點(diǎn)樣方法見表1。展開劑:三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液(展開劑混合均勻,放置于分液漏斗中,在2～8℃靜置分層,取下層溶液)。顯色劑:10%硫酸乙醇。檢測波長:510nm。將薄層板放入薄層掃描儀中,進(jìn)行薄層掃描,記錄各樣品峰面積積分、Rf值,要求相同樣品的峰面積積分RSD≤10%,0.2≤Rf≤0.8。外標(biāo)法計(jì)算供試品濃度。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:五味通栓口服液每支(10mL)含黃芪以黃芪甲苷計(jì),不得少于0.25mg。

表1 薄層掃描法測定黃芪甲苷含量點(diǎn)樣方法

2.1.3 測定結(jié)果 薄層掃描法測定結(jié)果(詳見表2),黃芪甲苷含量(mg/支)=(0.392 2+0.400 0)/2×2/20×96.9%×10=0.38>0.25。薄層掃描法測定五味通栓口服液中黃芪甲苷含量為0.38mg/支,符合規(guī)定。

表2 薄層掃描法測定黃芪甲苷含量結(jié)果

表3 加樣回收率考察結(jié)果

表4 線性關(guān)系

2.2 高效液相色譜法測定黃芪甲苷含量

2.2.1 溶液的配制 ①對(duì)照品溶液的配制:精密量取“2.1.1”項(xiàng)下0.928mg/mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液1mL,分別加甲醇定容至10mL、2mL,得到濃度為0.092 8mg/mL、0.464 0mg/mL的對(duì)照品溶液。②供試品溶液的制備:精密量取五味通栓口服液20mL,置分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取4次,每次20mL。收集正丁醇提取液,用2%氫氧化鈉溶液洗滌2次,每次20mL,棄去堿液。用正丁醇飽和的水30mL洗滌1次,棄去水液,收集正丁醇層,水浴蒸干,殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,過0.45μm微孔濾膜,即得。③陰性樣品溶液的制備:按五味通栓口服液處方比例,按標(biāo)準(zhǔn)制備工藝制成缺黃芪的陰性樣品,按②供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.2.2 色譜條件及測定法 采用Venusil XBP-C18(L)色譜柱,以乙腈-水(32∶68)為流動(dòng)相,柱溫30.0℃,流速1.0mL/min,進(jìn)樣量10μL,蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。記錄色譜圖,以外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)方程計(jì)算供試品含量。

2.2.3 方法學(xué)考察 (1)系統(tǒng)適用性考察。取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄保留時(shí)間、主峰面積、理論板數(shù)。主峰的保留時(shí)間相對(duì)一致(±1min),主峰峰面積對(duì)數(shù)的RSD=0.28%,理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算均不低于4 000。表明系統(tǒng)適用性及儀器的精密度良好。

(2)專屬性考察。分別取對(duì)照品溶液、缺黃芪的陰性樣品溶液、供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,見圖1-圖3。供試品溶液的主峰保留時(shí)間與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致(±1min),周圍無雜質(zhì)峰干擾;陰性樣品溶液色譜圖在與黃芪甲苷對(duì)照品相同的出峰時(shí)間內(nèi)無相應(yīng)的峰,表明該方法的專屬性良好。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品溶液色譜

圖2 缺黃芪陰性樣品溶液色譜

圖3 供試品溶液色譜

圖4 黃芪甲苷線性回歸方程

圖5 對(duì)照品溶液外標(biāo)兩點(diǎn)對(duì)數(shù)方程

(3)重復(fù)性考察。取同一樣品,同法制備6份供試品溶液,分別進(jìn)樣,記錄保留時(shí)間、主峰面積、理論塔板數(shù),計(jì)算供試品含量。主峰的保留時(shí)間相對(duì)一致(±1min),供試品平均含量為0.079 91mg/mL,供試品含量的RSD=2.1%,表明該方法重復(fù)性良好。

(4)準(zhǔn)確度考察。在線性范圍內(nèi),于供試品中精密加入一定量的對(duì)照品溶液,設(shè)計(jì)3種不同濃度,每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測定,用9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。高、中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待測成分量之比控制在1.5∶1,1∶1,0.5∶1。記錄供試品取樣量,供試品中含有量,對(duì)照品加入量,測定結(jié)果,回收率(%)及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。回收率=(實(shí)測值-供試品中含有量)/加入對(duì)照品量×100%。

(5)線性關(guān)系考察。精密量取“2.1.1”項(xiàng)下0.928mg/mL黃芪甲苷對(duì)照溶液1mL、1mL、2mL、3mL、5mL,分別加甲醇定容至10mL、5mL、5mL、5mL、5mL,作為線性工作液1-5。分別進(jìn)樣,記錄保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、主峰面積。以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),作線性回歸方程,得到回歸方程為y=1.418 6x+6.319,相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。表明黃芪甲苷的濃度在0.092 8～0.928 0mg/mL時(shí),峰面積對(duì)數(shù)與濃度對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

(6)色譜柱耐用性考察。使用不同色譜柱,測定同一供試品,計(jì)算其含量及RSD,詳見表5。兩種色譜柱測定同一供試品的結(jié)果表明,由于柱長不同,短柱出峰時(shí)間提前了8min,理論塔板數(shù)有所下降,但仍符合理論塔板數(shù)>4 000的要求。計(jì)算供試品含量,RSD<2.0%,表明兩種不同型號(hào)、規(guī)格的色譜柱對(duì)供試品含量測定沒有顯著影響,均可使用。

表5 色譜柱耐用性考察結(jié)果

(7)溶液穩(wěn)定性考察。取供試品溶液,密封保存。在制備后第0、8、12、24h進(jìn)樣測定,記錄保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、主峰面積,計(jì)算供試品中黃芪甲苷的含量。由表6可得,主峰的保留時(shí)間相對(duì)一致(17.6±1min),供試品中黃芪甲苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<2%,表明供試品溶液在密封條件下,穩(wěn)定性良好,可保存24h。

表6 供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.2.4 樣品測定 取與“2.1”薄層掃描法含量測定項(xiàng)下使用的相同樣品,按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理,測定結(jié)果見表7。

表7 供試品黃芪甲苷含量測定結(jié)果

以對(duì)數(shù)方程計(jì)算供試品濃度。

含量計(jì)算公式:含量(mg/支)=濃度×5/20×96.9%×10

色譜基線分離,無干擾,供試品溶液主峰保留時(shí)間與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間相對(duì)一致,主峰周圍無雜峰干擾。HPLC-ELSD測得五味通栓口服液中黃芪甲苷含量為0.831 2mg/支。

3 討論

本研究建立了HPLC-ELSD測定五味通栓口服液中黃芪甲苷含量的方法,確定了供試品制備方法,確定了色譜條件:使用Venusil XBP-C18(L)色譜柱或ZORBAX SB-C18色譜柱,以乙腈-水(32∶68)為流動(dòng)相,柱溫30.0℃,流速1.0mL/min,進(jìn)樣量10μL,ELSD檢測。方法學(xué)考察結(jié)果表明,該方法的系統(tǒng)適用性、專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、線性、色譜柱耐用性、溶液穩(wěn)定性符合規(guī)定,其中,重復(fù)性和準(zhǔn)確度的限度要求來源于《中華人民共和國藥典》2020版中9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[13]。與五味通栓口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中薄層掃描法相比,操作簡單快捷,準(zhǔn)確度更高,重復(fù)性更好,受人為因素影響小。對(duì)同一供試品,薄層掃描法測得含量為0.38mg/支,本方法為0.831 2mg/支。說明在相同的供試品處理方法下,薄層掃描法因其方法本身所限,測得黃芪甲苷含量偏低,對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測局限性更大。可將HPLC-ELSD測定黃芪甲苷含量作為五味通栓口服液質(zhì)量控制的方法。