正交試驗(yàn)結(jié)合HPLC指紋圖譜優(yōu)選高良姜一體化炮制工藝

鄧仙梅,郭 洪,甘柯林

(肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 藥學(xué)院,廣東 肇慶 526020)

高良姜為姜科植物高良姜AlpiniaofficinarumHance的干燥根莖,具有溫胃止嘔、散寒止痛的功效,被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床治療脘腹冷痛、胃寒嘔吐、噯氣吞酸等[1]。此外,高良姜屬于藥食同源之品,素有姜中之王的美稱(chēng),其氣味芳香而獨(dú)特,故從古至今又被廣泛用作食品調(diào)味料、香料、咖喱粉等。高良姜價(jià)格高、銷(xiāo)路廣,主產(chǎn)于廣東、廣西、海南等地,尤以廣東湛江徐聞產(chǎn)者質(zhì)量最佳,是我國(guó)出口創(chuàng)匯的大宗農(nóng)副品種。

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)高良姜藥材產(chǎn)地加工與飲片炮制分別描述,其中藥材產(chǎn)地加工為:“夏末秋初采挖,除去須根和殘留的鱗片,洗凈,切段,曬干。”飲片炮制則為:“除去雜質(zhì),洗凈,潤(rùn)透,切薄片,曬干。”[1]這種飲片生產(chǎn)工藝使得高良姜藥材要經(jīng)過(guò)2次水處理以及2次干燥過(guò)程,這增加了生產(chǎn)成本并可能導(dǎo)致有效成分流失。為縮短高良姜飲片生產(chǎn)工藝過(guò)程,減少中間儲(chǔ)存環(huán)節(jié),降低成本,提高飲片質(zhì)量,本研究采用正交試驗(yàn)法結(jié)合HPLC指紋圖譜法探索高良姜藥材趁鮮切制干燥的一體化飲片生產(chǎn)工藝的可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀聯(lián)用DAD檢測(cè)器,Sartorius BP124S型電子天平(感量:0.1mg,德國(guó)),Sartorius BP211D型電子天平(感量:0.01mg,德國(guó)),KQ250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),LSF-80型高速粉碎機(jī)(常德市中藥機(jī)械廠)。電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 材料

高良姜藥材采集于廣東湛江,經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為姜科植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖—高良姜。高良姜素(中國(guó)食品藥品檢定研究院,HPLC≥99.8%)。實(shí)驗(yàn)所用水為純化水(超純水機(jī),廣州盟歐儀器有限公司),甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 高良姜素的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取高良姜素對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,置于容量瓶中,加入甲醇溶解定容至刻度,配成濃度為3.5mg/mL的對(duì)照品母液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｎ?60μL置于1mL容量瓶中,加入甲醇定容至刻度,即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 分別稱(chēng)取高良姜、鹽炙高良姜樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.75g,精密稱(chēng)定,置于150mL具塞錐形瓶中,加甲醇25mL,精密稱(chēng)定,超聲提取40min,室溫放冷,稱(chēng)重,加入甲醇補(bǔ)足重量,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.1.3 色譜條件 按照本課題組已建立的HPLC法色譜條件[2]。

按照以上方法條件進(jìn)行專(zhuān)屬性試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖1。在該方法下測(cè)定高良姜樣品的指紋圖譜和高良姜素含量專(zhuān)屬性強(qiáng),穩(wěn)定可行。

圖1 高良姜素對(duì)照品和高良姜樣品HPLC圖

2.2 水浸提物含量測(cè)定

參考2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)2201浸出物測(cè)定法,測(cè)定樣品中水熱浸出物含量[3]。

2.3 加權(quán)評(píng)分OD值算法

根據(jù)樣品HPLC指紋圖譜峰面積的百分比發(fā)現(xiàn)高良姜素的峰面積約占總峰面積的40%,故確定水浸提物與高良姜素的權(quán)重系數(shù)分別為0.6和0.4,OD=(水浸出物含量/水浸出物含量最大值×0.6×100)+(高良姜素含量/高良姜素含量最大值×0.4×100)。

2.4 一體化工藝優(yōu)選

2.4.1 篩選干燥方法 稱(chēng)取200g高良姜鮮藥材,用切藥刀切成4mm厚片,然后將該批飲片平均分成2份,第一份用太陽(yáng)曬干,第二份用熱鼓風(fēng)烘干機(jī)50℃烘干。干燥后,分別取2份樣品按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下測(cè)定高良姜素含量和水浸出物含量,每份樣品平行做2份后取平均值。其結(jié)果為曬干品熱浸出物為35.2%,高良姜素含量為1.35%,加權(quán)評(píng)分值為91.61;烘干品熱浸出物為39.15%,高良姜素含量為1.04%,加權(quán)評(píng)分值為92.51。結(jié)果表明烘干品比曬干品高良姜素含量稍高,但二者比較,并無(wú)顯著性差異。因烘干法不受天氣、場(chǎng)地的影響,故本實(shí)驗(yàn)選取烘干法對(duì)高良姜飲片進(jìn)行干燥。

2.4.2 正交表的選擇及因素水平設(shè)計(jì) 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示切片厚度、干燥溫度、干燥時(shí)間均會(huì)影響飲片質(zhì)量。因此,根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選取切片厚度(A/mm)、干燥溫度(B/℃)、干燥時(shí)間(C/h)作為高良姜一體化工藝考察因素,每個(gè)因素選取3個(gè)水平,選擇L9(3)4正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),詳情見(jiàn)表1。

表1 高良姜一體化工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以高良姜素含量、水溶性浸出物百分含量作為工藝優(yōu)選的主要評(píng)價(jià)指標(biāo),并輔以外觀性狀、含水量作為參考評(píng)價(jià)指標(biāo)。按表1安排進(jìn)行正交試驗(yàn),所得飲片粉碎過(guò)4號(hào)篩,然后按照“2.1和2.2”項(xiàng)進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。其結(jié)果見(jiàn)表1,方差分析見(jiàn)表2。

表2 方差分析

直觀分析結(jié)果中的k1,k2,k3值分別為每個(gè)因素的各個(gè)水平下的指標(biāo)平均值,其值越大則表示該因素的該水平對(duì)指標(biāo)結(jié)果影響越大。R值則為極差(極差=平均OD最大值-平均OD最小值),R值越大反映其因素對(duì)指標(biāo)的影響越大。根據(jù)表1結(jié)果中的R值大小可知影響高良姜一體化工藝飲片質(zhì)量的因素主次順序?yàn)锽>C>A,比較其k值可得出其最佳一體化工藝組合為A②B①C③。即高良姜趁鮮切制4mm厚片,然后50℃烘16h即得。但正交試驗(yàn)中沒(méi)有該實(shí)驗(yàn)組合,故需要對(duì)該優(yōu)選工藝進(jìn)一步驗(yàn)證。

方差分析結(jié)果表明,切片厚度、干燥溫度以及干燥時(shí)間這三個(gè)因素對(duì)高良姜飲片質(zhì)量均有顯著性影響。見(jiàn)表2。

3.2 最佳一體化工藝驗(yàn)證及其與傳統(tǒng)工藝的比較

取大小均勻的同批新鮮高良姜藥材12kg,分別按照最佳工藝(新鮮高良姜切4mm厚片,置于干燥箱內(nèi) 50℃、16h烘干)和2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定的傳統(tǒng)方法炮制高良姜飲片。每種加工方法平行做3份(2kg/份),然后分別測(cè)定各組飲片水溶性浸出物以及高良姜素含量,并采集各樣品的指紋圖譜(色譜條件采用本課題組已建立的HPLC指紋圖譜測(cè)定方法[4]),驗(yàn)證一體化工藝合理性,比較一體化工藝與傳統(tǒng)工藝的差異。

3.2.1 含量指標(biāo)分析 對(duì)各含量指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)評(píng)分分析,結(jié)果見(jiàn)表3。3份平行驗(yàn)證工藝實(shí)驗(yàn)的高良姜素及浸出物含量均較高,與正交試驗(yàn)篩選的工藝結(jié)果相吻合,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳一體化飲片生產(chǎn)工藝可行。

表3 一體化最佳工藝驗(yàn)證以及傳統(tǒng)工藝含量測(cè)定結(jié)果

驗(yàn)證工藝綜合加權(quán)評(píng)分OD均值為93.71,傳統(tǒng)工藝綜合加權(quán)評(píng)分OD均值為89.97。分別對(duì)這2組不同工藝所得樣品的高良姜素含量和浸出物含量結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn),結(jié)果顯示,由本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的一體化工藝所得高良姜飲片與按傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)所得的高良姜飲片中的高良姜素含量、浸出物含量以及加權(quán)評(píng)分OD值均無(wú)顯著性差異(P≥0.05)。即表明本實(shí)驗(yàn)建立的高良姜一體化飲片炮制工藝跟傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的飲片質(zhì)量一致,甚至略勝一籌。故本試驗(yàn)優(yōu)選出來(lái)的高良姜一體化炮制工藝切實(shí)可行。

3.2.2 HPLC指紋圖譜分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A版)”軟件對(duì)驗(yàn)證工藝所得的高良姜和傳統(tǒng)工藝所得的高良姜樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。指紋圖譜能表征工藝參數(shù)變化和飲片的整體質(zhì)量的相關(guān)性,該結(jié)果顯示這2種方法所得飲片的相似度均很高,見(jiàn)圖2、表4,且對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析也無(wú)法將其聚為2類(lèi),見(jiàn)圖3,表明本試驗(yàn)優(yōu)選高良姜飲片一體化炮制工藝與傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)所得的飲片相一致,所得最優(yōu)炮制工藝合理可行。

表4 兩種工藝所得高良姜飲片的指紋圖譜相似度

注:S1-S3為驗(yàn)證工藝樣品,S4-S6為傳統(tǒng)工藝樣品,R為對(duì)照指紋圖譜。

注:S1-S3為驗(yàn)證工藝樣品,S4-S6為傳統(tǒng)工藝樣品。

4 討論

在2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中,高良姜的質(zhì)量控制指標(biāo)主要為高良姜素含量、性狀。現(xiàn)代藥理研究表明,高良姜素可以改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[5]、改善胰島素抵抗作用[6],有抗腫瘤[7-10]、抗菌[11]、抗胃炎[12]等多種藥理活性。此外,因高良姜飲片在臨床運(yùn)用主要入湯劑,故本實(shí)驗(yàn)選取高良姜素含量、水溶性浸出物百分含量作為工藝優(yōu)選的主要評(píng)價(jià)指標(biāo),并輔以外觀性狀、含水量作為參考評(píng)價(jià)指標(biāo)。此外,本實(shí)驗(yàn)尚采用HPLC指紋圖譜結(jié)合聚類(lèi)分析法來(lái)表征工藝參數(shù)與飲片質(zhì)量的相關(guān)性。評(píng)價(jià)指標(biāo)是全面、合理可行的。

本試驗(yàn)首次對(duì)高良姜趁鮮切制進(jìn)行研究,所優(yōu)選的高良姜產(chǎn)地加工與炮制生產(chǎn)一體化飲片工藝為將高良姜趁鮮切制4mm厚片,50℃烘16h即得。驗(yàn)證試驗(yàn)信息含量指標(biāo)加權(quán)評(píng)分、指紋圖譜分析和聚類(lèi)分析結(jié)果均表明該一體化工藝生產(chǎn)所得的飲片與按傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)所得飲片質(zhì)量一致,表明該工藝切實(shí)可行。且該工藝具有不受時(shí)間、天氣影響的優(yōu)勢(shì),可及時(shí)快速干燥飲片,并能保證飲片質(zhì)量?jī)?yōu)良。此外,采用該工藝可縮短高良姜飲片生產(chǎn)的工藝周期,減少中間儲(chǔ)存環(huán)節(jié),大大降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效益。故該高良姜飲片一體化炮制工藝具有較好的應(yīng)用價(jià)值,值得推廣應(yīng)用,以提高該藥材的經(jīng)濟(jì)效益。