四氯蟲酰胺對斑馬魚急性毒性及黑色素合成的影響

鄭世祥，張太宇，郭雨昭，張 潔，范詠梅

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林災害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228）

四氯蟲酰胺（Tetrachlorantraniliprole）是我國自主研發的雙酰胺類殺蟲劑，2013 年在農業農村部獲得登記，具有高效、低毒、廣譜的特點[1]。已有研究報道，10%四氯蟲酰胺懸浮劑對玉米田棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[2]和玉米螟（Pyrausta nubilalis）[3]有較好的防治效果。四氯蟲酰胺對水稻二化螟（Chilo suppressalis）[4]和水稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）[5]田間防治效果較好，但藥劑在水稻田的噴灑使用行為會造成水體環境污染，從而對水生生物產生毒性危害。四氯蟲酰胺與甲維鹽復配對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）有較好的防治效果[6]，但由于農藥在生態環境中的遷移轉化，會對非靶標生物產生一定的影響，如雙酰胺類農藥氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺對螟黃赤眼蜂（Trichogramma chilonis Ishii）成蜂表現為低風險性[7]；在水生生態系統中，溴氰蟲酰胺會 影響羊角月牙藻（Selenastrum bibraianum）的光合作用并抑制生長[8]；10%四氯蟲酰胺懸浮劑對家蠶（Bombyx moriLinnaeus）的毒性為中毒，96 h 的LC50為27.28 mg·L-1；10%四氯蟲酰胺懸浮劑對水生生物鯉魚（Cyprinus carpio）為低毒，96 h的LC50為89.11 mg·L-1[9]。黑色素是通過一個復雜的過程被合成為紫外線防御機制，該過程涉及一系列酶和多種信號轉導途徑。黑色素生成是由酪氨酸酶基因（Tyr）催化的酪氨酸經中間體3,4-二羥基苯丙氨酸氧化為多巴醌而引發的；在沒有巰基（例如半胱氨酸或谷胱甘肽）的情況下，黑色素合成途徑中的第二種酶酪氨酸酶相關蛋白2（Trp-2）將多巴醌迅速轉化為多巴色素，隨后將多巴色素轉化為5,6-二羥基吲哚（DHI）或吲哚5，6-醌2-羧酸（DHICA）；參與黑色素合成的最后一種酶，即酪氨酸酶相關蛋白1 （Trp-1），催化DHICA的氧化形成直鏈黑色素[10]。Tyr是一種糖蛋白，它的糖基化和降解作用在抗黑素形成劑的開發中起著至關重要的作用。小眼癥相關轉錄因子（MITF），通過轉錄調節Tyr，Trp-1和Trp-2表達在黑色素生成中起重要作用，為此MITF為黑色素生成的主轉錄因子[11]。SRY-box轉錄因子10 （Sox10）可以調節小眼癥相關轉錄因子Mitf/mitfa的表達，Sox10在分化前的神經嵴細胞中廣泛表達。Sox10功能的喪失會導致斑馬魚（Danio rerio）和小鼠（Mus musculus）中黑色素細胞和大多數其他神經嵴衍生細胞完全或部分缺失，因此Sox10對于黑色素細胞的發育非常重要[12]。

目前未見有四氯蟲酰胺原藥對模式生物斑馬魚的毒性影響力的研究報道。本研究以斑馬魚為研究對象，通過靜態染毒觀察農藥暴露對斑馬魚胚胎生長發育的影響；同時通過RT-qPCR 方法研究四氯蟲酰胺原藥對斑馬魚胚胎黑色素合成的相關基因的影響，以期為四氯蟲酰胺農藥的生態風險評估提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 化學品和儀器四氯蟲酰胺（純度96%，CAS：1104384-14-6），購自海南青峰生物科技有限公司；Tween-80、二甲基甲酰胺（DMF）購自Solarbio 科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海立菲生物技術有限公司；Trizol 試劑購自Invitrogen 科技有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒購自Roche 公司；SYBR Green I Master（Roche diagnostics A/S）試劑盒購自Roche 公司；Triple Quad 6500+超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀UPLC-MSMS（SCIEX 美國Waters 公司）；LightCycler96 R 實時熒光定量PCR 儀（Roche 公司）。

1.2 水樣中四氯蟲酰胺的測定

1.2.1 樣品處理試驗分別在24，48，72，96 h 對各試驗濃度四氯蟲酰胺藥液取樣，并對樣品進行前處理。樣品前處理：將試驗藥液稀釋成設定的濃度的10 倍，取1mL 稀釋后的藥液并加入9 mL的甲醇，使得水藥液與甲醇的體積比為1∶9，再渦旋，搖勻，取1 mL 經0.22 μm 過濾膜過濾后轉移到樣品瓶。

1.2.2 標準溶液的配制根據試驗設定標準曲線濃度為0.005，0.01，0.05，0.1，0.2 μg·mL-1。

1.2.3 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相A：超純水，流動相B：乙腈，梯度洗脫程序：0～0.5 min，保持初始10%的乙腈；0.5～2 min，乙腈的比例線性增加從10%～95%；2～5 min，保持95%的乙腈3 min；5.0～5.2 min，乙腈的比例線性下降從95%～10%；5.2～8.0 min，保持10%的乙腈2.8 min。每個樣品進樣結束，儀器平衡5 min。流速：0.25 mL·min-1。

1.2.4 質譜條件離子化方式：電噴霧離子源（ESI)；檢測模式：多反應檢測模式（MRM)；掃描方式為負離子掃描（ESI-），一級掃描范圍(m/z)：201.9～535.8，二級掃描范圍(m/z)：499.7～535.8；氣簾氣：0.28 Mpa；碰撞氣：0.06 Mpa；去簇電壓(DP)：70 V；碰撞能量(CE)：5 eV；離子噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550℃。

1.2.5 添加回收和精度設定加標濃度分別為0.01、0.02、0.05 μg·mL-1。然后按照上述的分析方法測定,并根據建立的基質標準方程，采用外標法計算回收濃度，根據 SANCO/12 571/2013[13]的要求計算回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.3 斑馬魚的飼養及產卵試驗用AB 野生型斑馬魚(Danio rerio)引自國家斑馬魚中心，并參照OECD 標準[14]，采用北京愛生科技公司的斑馬魚養殖系統飼養，飼養中嚴格控制飼養條件。飼養條件：室溫28 ℃，水的pH 為7.5 左右，水中電導率550 μS·cm-1左右，通過加氧泵使水中含氧量在80%以上，調節養殖時的光暗比為14 h∶10 h。

斑馬魚胚胎的獲取：將5 cm 左右的成年斑馬魚按照雌雄比例為1∶2 的標準放到孵化盒中用擋板隔開，并控制光暗比（14 h∶10 h），次日拔掉擋板，使得雌雄魚之間自由交配，收集交配后30 min 之內的胚胎，并小心地用孵化液清洗。

1.4 四氯蟲酰胺對斑馬魚的急性毒性試驗

1.4.1 試驗方法以及濃度設計按照OECD 標準[14]開展斑馬魚胚胎急性毒性試驗，采用靜態染毒法將暴露于四氯蟲酰胺的斑馬魚胚胎放到24 孔板中觀察，根據預實驗的結果，設計6 個實驗濃度為：16.00，19.20，23.04，27.65，33.18，39.80 mg·L-1（公比為1.2）。在試驗過程中設置溶劑對照SC 和空白對照CK，并且每個濃度選取20 個觀察胚胎。

1.4.2 藥液設置四氯蟲酰胺原藥試驗質量濃度： 16.00、 19.20、 23.04、 27.65、 33.18、 39.80 mg·L-1。溶劑和助劑采用DMF 和Tween-80，其最高用量低于0.1%。

1.4.3 試驗現象觀察及數據處理根據OECD 標準[14]分別于暴露24、48、72、96 h，使用體視顯微鏡觀察統計各項指標（死亡率、自主運動、孵化率及體長等）。

1.5 斑馬魚胚胎黑色素含量分析通過image-J軟件對斑馬魚胚胎黑色素顏色區域進行提取，得到黑色素整體面積。將圖片進行Color Inspector 3D 軟件分析得到RGB 三維顏色分析圖片，通過直觀圖片中黑色區域來表現黑色素的變化。

1.6 基因的表達分析使用Trizol 試劑提取斑馬魚胚胎染毒24 h 后各濃度的總RNA，包括溶劑對照SC 和空白對照CK。采用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，并使用Roche 公司的Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，檢測的基因和實時熒光定量PCR 引物序列見 表1。將各濃度反轉錄成的cDNA 分別稀釋到同一濃度后，使用SYBR Green I Master（Roche diagnostics A/S）試劑盒方法在LightCycler96 R（Roche diagnostics A/S）儀器上進行實時定量PCR 擴增。擴增條件：95℃預變性10 min，循環1 次，然后95℃進行15 min，在60℃下退火20 min，以及72℃下延伸20 min，40 個循環。RT-qPCR 結果數據分析采用2-ΔΔCt方法，每個基因進行3 個技術重復。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.7 統計分析使用體視顯微鏡觀察統計各項指標（死亡率、自主運動、孵化率及體長等）。試驗結果用SPSS Statisitics 22.0 軟件分析計算LC50。并采用Dunnett’s 方法對每個濃度處理的結果和空白對照的結果進行比較，差異不顯著用P＞0.05 表示，差異顯著性用P＜0.05 和P＜0.01 表示。

2 結果與分析

2.1 超高效液相色譜-串聯質譜法測定水中四氯蟲酰胺的濃度標準曲線的擬合方程為y=5.07e+0.05x(R2=0.999 1)；四氯蟲酰胺的加標濃度0.01，0.02 和0.05 μg·mL-1對應的平均回收率分別為97.98%，101.60%和103.92%，相對標準偏差（RSD）在4.3%～6.0%，說明該方法有較好的回收率。

按照上述儀器條件和樣品前處理方法，以甲醇為陽性對照，對水中四氯蟲酰胺的濃度進行檢測，通過檢測24、48、72 、96 h 中各樣品分別在甲醇和水中的濃度（表2），四氯蟲酰胺在水中96 h 的最高降解率為7.6%，濃度大于80%。因此，四氯蟲酰胺在水中96 h 穩定性良好，滿足OECD 標準中靜態染毒法的要求。

表2 四氯蟲酰胺的檢測濃度

2.2 四氯蟲酰胺對斑馬魚的急性毒性斑馬魚胚胎暴露在四氯蟲酰胺24 h 和48 h 的LC50均為112.88 mg·L-1， 72 h 的LC50為30.421 mg·L-1，95%置信區間（CI）為27.652～34.480 mg·L-1；96 h的LC50為23.775 mg·L-1，95%置信區間（CI）為22.066～25.582 mg·L-1（表3）。

表3 四氯蟲酰胺對斑馬魚胚胎急性毒性

2.3 四氯蟲酰胺對斑馬魚胚胎發育的影響

2.3.1 自主運動頻率增加試驗結果表明，溶劑對照組和空白對照組沒有明顯差異。處理后24 h，隨著四氯蟲酰胺濃度的增加斑馬魚胚胎每分鐘自主運動頻率加快(圖1)，當四氯蟲酰胺暴露濃度高于27.65 mg·L-1時，斑馬魚胚胎自主運動頻率與對照相比差異即達顯著水平（P＜0.01），其中自主運動對照組為0.25 次·min-1，暴露濃度為39.8 mg·L-1時，斑馬魚胚胎自主運動頻率達到5.5次·min-1，為對照自主運動頻率的22 倍。

圖1 四氯蟲酰胺暴露24 h 對斑馬魚胚胎自主運動頻率的影響

2.3.2 孵化率降低暴露時間72 h 和96 h 四氯蟲酰胺對斑馬魚胚胎孵化率有明顯的抑制作用。暴露96 h 斑馬魚胚胎的孵化率也受到明顯抑制，其中，暴露于四氯蟲酰胺濃度在19.02 mg·L-1以上，與對照相比，暴露濃度在19.02 mg·L-1時的孵化率下降了15%，暴露濃度在27.65 mg·L-1時斑馬魚胚胎孵化率下降75%以上（圖2） 。用16.00 mg·L-1四氯蟲酰胺溶液暴露斑馬魚胚胎，四氯蟲酰胺暴露96 h 顯著抑制斑馬魚胚胎的正常生長發育，斑馬魚胚胎的體長隨著四氯蟲酰胺濃度的增加而降低（圖3）。當四氯蟲酰胺暴露濃度高于16.00 mg·L-1時，斑馬魚胚胎的體長與對照相比差異即達顯著水平（P＜0.01），其中體長對照組為2.755 mm，暴露濃度為39.8 mg·L-1時，斑馬魚體長為0.677 mm，較對照減少了32.27%。

圖2 四氯蟲酰胺不同暴露時長對斑馬魚胚胎孵化率的影響

圖3 暴露96 h 對斑馬魚胚胎體長的影響

2.4 四氯蟲酰胺對斑馬魚黑色素生成的影響四氯蟲酰胺暴露24、48 、72 、96 h 的斑馬魚胚胎與空白對照相比，發現四氯蟲酰胺對斑馬魚胚胎的色素沉著產生影響（圖4），隨著四氯蟲酰胺處理濃度的增加斑馬魚黑色素區域顯著減少。通過Image-J 使用RGB 三維色素模型分析結果表明，與空白對照相比，黑色素區域的密度隨著暴露濃度的增加而顯著降低（圖5）。四氯蟲酰胺暴露24 h 通過計算黑色素面積發現隨著四氯蟲酰胺濃度的增加，斑馬魚黑色素面積明顯減少，最高四氯蟲酰胺暴露濃度39.8 mg·L-1與空白相比黑色素面積減少了80%（圖6）。四氯蟲酰胺暴露48 h 和72 h 隨著四氯蟲酰胺濃度的增加，斑馬魚胚胎黑色素面積顯著減少，并且和暴露濃度之間有著良好的劑量效應關系。暴露濃度33.18 mg·L-1與空白相比黑色素面積減少了60%。四氯蟲酰胺暴露96 h 斑馬魚胚胎黑色素面積隨著四氯蟲酰胺暴露濃度的增加明顯減少，最高暴露濃度39.8 mg·L-1與空白相比黑色素面積減少了65%。

圖4 斑馬魚胚胎黑色素形態觀察

圖5 斑馬魚胚胎黑色素RGB 三維色素模型

圖6 四氯蟲酰胺不同暴露時長對斑馬魚胚胎黑色素面積的影響

2.5 四氯蟲酰胺暴露對斑馬魚黑色素相關基因表達的影響對RT-qPCR 結果分析表明，在急性濃度暴露下四氯蟲酰胺會影響斑馬魚黑色素合成相關基因的變化，分別使用β-actin和GAPDH兩個內參基因對斑馬魚黑色素合成相關基因進行分析（圖7、圖8），發現2 個內參基因趨勢一致。

圖7 四氯蟲酰胺暴露24 h 下斑馬魚胚胎黑色素合成相關基因的差異分析

圖8 四氯蟲酰胺暴露24 h 下斑馬魚胚胎黑色素合成相關基因的差異分析

2.5.1 以β-actin為內參基因的結果以β-actin內參基因進行結果分析，圖7-a 中Tyr，Sox10，Trp-1a，Mitfa基因在處理濃度23.04 mg·L-1以上的表達量隨著濃度的增加先上調后下調，相比對照CK 最高處理濃度的基因表達量分別是對照的0.15 倍、0.43 倍、0.96 倍和1.30 倍；圖8-a 表明四氯蟲酰胺暴露24 h 誘導斑馬魚胚胎黑色素合成通路中Tyr，Sox10，Trp-1a，Mitfa，Dicer，Trp-1b等基因表達量變化趨勢，其中Sox10基因與Mitfa基因變化幅度較大，且趨勢相對較一致，均呈現上調趨勢，Trp-1a次之，說明這3 個基因在四氯蟲酰胺誘導斑馬魚胚胎黑色素合成過程中起關鍵作用（圖7-a、圖8-a）。

2.5.2 以GAPDH為內參基因的結果以GAPDH內參進行結果分析，圖7-b 中，Sox10，Tyr，Trp-1a，Mitfa基因在處理濃度27.65 mg·L-1以上的表達量隨著濃度的增加呈現出先上調后下調的現象，相比對照CK 最高處理濃度的基因表達量分別是對照的0.60 倍、0.14 倍、1.34 倍和1.82 倍。圖8-b表明 四氯蟲酰胺暴露24 h 誘導斑馬魚胚胎黑色素合成通路中Tyr，Sox10，Trp-1a，Mitfa，Dicer，Trp-1b等基因表達量變化趨勢，其中Sox10、Mitfa基因變化幅度較大，Trp-1a次之,說明這3 個基因在四氯蟲酰胺誘導斑馬魚胚胎黑色素合成過程中起關鍵作用（圖7-b、圖8-b）。

3 討 論

斑馬魚為評價除草劑、殺蟲劑和殺菌劑等農藥對環境的影響提供了有前景的生物平臺。有機磷殺蟲劑殺螟松暴露72 h 對斑馬魚的急性毒性平均 LC50為0.341 mg·L-1，并誘導卵黃囊腫等軀體畸形[15]。殺菌劑三氯生暴露96 h 對斑馬魚胚胎急性毒性平均LC50為0.42 mg·L-1，顯著延遲孵化[16]；有機磷農藥久效磷 (MCP) 對斑馬魚胚胎具有中等毒性，暴露96 h 的LC50為（37.44 ± 3.32）mg·L-1[17]；除草劑2,4-D 對斑馬魚胚胎的急性毒性暴露96 h的LC50為15.010 mg·L-1，表明毒性為低毒[18]。乙基多殺菌素對斑馬魚胚胎的毒性為低毒并具有致畸作用，暴露96 h 的LC50為9.713 mg·L-1[19]，黃偉康[20]研究了溴氰蟲酰胺對斑馬魚胚胎的急性毒性，暴露96 h 的LC50為1.57 mg·L-1，屬于中毒范圍。四氯蟲酰胺是我國自主研發的具有低毒、高效等特點的殺蟲劑，本研究按照OECD 的準則開展了四氯蟲酰胺原藥對斑馬魚胚胎的急性毒性試驗，暴露96 h 的LC50為23.775 mg·L-1，結果表明為低毒，這與張琦[9]報道的10%四氯蟲酰胺懸浮劑對水生生物鯉魚的結果相似。本試驗結果表明與對照相比，隨著四氯蟲酰胺濃度的升高斑馬魚胚胎在暴露96 h 下的孵化率降低、自主運動頻率增加以及體長降低，并且較高濃度四氯蟲酰胺顯著地減少斑馬魚黑色素的面積。新型吡啶基惡唑甲酰胺可以引起斑馬魚胚胎的黑色素細胞缺失現象[21]，說明化學物質在水體中會對斑馬魚黑色素細胞的生成產生影響，本研究結果表明四氯蟲酰胺對斑馬魚胚胎黑色素的合成有顯著的抑制作用，這與前人的結果具有相似性。

與黑色素合成相關基因的報道中，Mitfa是在黑色素母細胞前體中表達的早期基因之一，Mitfa置于產生黑色素和最終分化黑色素細胞所必需的多個基因的上游，包括多巴色素互變異構酶，酪氨酸酶，酪氨酸酶相關蛋白1，C-kit和Bcl2轉錄因子[22]。也有研究報道表明，Mitf作為主導作用的天然木質素通過下調Mitf和Tyr的表達，從而有效地抑制斑馬魚黑色素細胞的生成[23]；在新型污染物三氯卡班影響斑馬魚幼蟲黑色素生成的研究報道中，也指出Mitfa（小眼相關轉錄因子）和Tyr（酪氨酸酶）的表達水平的變化是影響黑色素合成的關鍵因子[24],本研究中Mitf基因是四氯蟲酰胺誘導斑馬魚黑色素減少變化最大的基因。另文獻[25]報道，在損害神經嵴細胞分化的過程中Sox10和Mitfa轉錄所涉及的成熟miRNA 的生成來實現存在一致性。黑色素細胞由Sox10轉錄因子核心參與的神經嵴細胞生成，Sox10通過Mitfa啟動子直接驅動黑色素細胞的命運，存在調控關系[26]，且Mitf/mitfa作為黑色素分化多個關鍵基因的上游基因，決定黑色素細胞的命運，導致黑色素細胞的生成和發育受到影響。本研究結果顯示，Sox10基因與Mitfa基因變化幅度較大，且趨勢相對較一致，均呈現上調超勢。

黑色素生物取決于酪氨酸酶家族的3 種酶的功能，有研究表明酪氨酸酶 (Tyr)、酪氨酸酶相關蛋白1 (Tyrp1) 和多巴色素互變異構酶 (Dct 或Tyrp2)等3 種酶的功能直接影響黑色素的生物合成，其中酪氨酸酶相關蛋白的異常表達會導致黑色素細胞死亡[27]，有文獻報道殺菌劑惡霉靈通過抑制酪氨酸酶活性降低了斑馬魚胚胎黑色素密度[28]，本研究中酪氨酸酶相關基因Trp-1a也是變化較大的3 個基因之一。