冷誘導RNA 結合蛋白在大鼠低體溫性急性肺損傷中的表達變化

徐耀迪，王佳新，陳旭昕，張春陽，王 凡，丁毅偉，彭 聰，肖 漓，韓志海,1

1 華南理工大學醫學院，廣東廣州 510006；2 解放軍總醫院第六醫學中心呼吸與危重癥醫學科，北京100048；3 解放軍總醫院研究生院，北京 100853；4 解放軍總醫院第八醫學中心呼吸與危重醫學部研究所，北京市器官移植與免疫調節重點實驗室，北京 100091

我國海域遼闊，海洋貿易、海上作業等海上活動日漸增多，海難也時有發生。遇難者在低溫海水中浸泡時間過長會發生海水浸泡性體溫過低癥。根據人體核心體溫將體溫過低分為三類：輕度 (32°C ～ 35°C)、中度 (28°C ～ 32°C) 和重度(＜28°C)[1-2]。肺是體溫過低癥損傷的主要靶器官之一，既往有許多臨床案例報道重度低體溫癥患者會出現明顯呼吸抑制，并伴有肺炎、肺水腫甚至肺損傷等并發癥，病情嚴重會造成患者死亡[3-4]。低體溫性急性肺損傷(acute lung injury，ALI)病情嚴重且復雜，發生機制不明，研究低體溫性ALI的致傷機制可以為臨床救治提供參考。本課題組前期研究發現低溫海水長時程浸泡后大鼠肺部出現明顯的損傷，以肺水腫、肺泡及間質炎性細胞浸潤為主，部分血管內見血栓形成[5]。很多研究發現ALI 進展與多種基因和蛋白分子的表達水平相關。有研究報道體溫降低時冷誘導RNA 結合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)表達增加[6-7]。CIRP 是一種低溫誘導蛋白，細胞內CIRP(intracellular cold-inducible RNA-binding protein，iCIRP)維持全身細胞內mRNA 的穩定性并調節著機體低體溫下的生命活動，其表達異常與炎癥因子的分泌密切相關，并呈溫度和時間依賴性[8-9]。當CIRP 從胞內釋放變成細胞外CIRP (extracellular cold-inducible RNA-binding protein，eCIRP)，就成為了一種損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，可以獨立促進炎癥反應[10-12]，既往研究發現巨噬細胞釋放的eCIRP在膿毒癥ALI、失血性休克ALI、急性胰腺炎相關ALI 和放射性ALI 中發揮著重要作用[13-18]，但在低體溫性ALI 中尚無研究。本研究通過觀察分析細胞內和細胞外CIRP 水平變化，為低體溫性ALI 的診治提供實驗依據，以期最終提高患者的存活率。

材料與方法

1 主要材料和試劑 大鼠白細胞介素(interleukin，IL)-6、 IL-1β ELISA 試劑盒購于深圳欣博盛生物科技有限公司、大鼠CIRP ELISA 試劑盒購于武漢優爾生生物有限公司、人工海鹽購于廣州益而生物工程有限公司，蘇木素、伊紅購于廣州維格斯生物科技有限公司，二甲苯購于天津凱信化學工業有限公司，兔抗鼠 CIRP 單克隆抗體購于英國Abcam 公司，山羊血清封閉液、DAB 顯色液購于北京中杉金橋生物技術有限公司，原位末端轉移酶標記法(TUNEL)試劑盒購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

2 實驗動物 健康清潔SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠，體質量330 ～ 380 g，共40 只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK(京)2021-0006。動物實驗相關方案通過解放軍總醫院動物倫理委員會批準(受理編號：SQ2022494)。

3 動物實驗分組及造模 8 周齡雄性SD 大鼠，隨機分為5 組：0 h 組(0 h)、12 h 低溫組、16 h 低溫組、20 h 低溫組、24 h 低溫組，每組8 只。0 h 組與實驗組在相同條件下飼養，室溫為20℃ ～22℃，保證正常的晝夜節律。本研究改進了課題組的長時程海水浸泡體溫過低癥大鼠模型。通過前期預實驗比較不同溫度下大鼠存活率和肺損傷情況，得出18℃為適宜的造模溫度。用自來水將人工海鹽配成3%的人工海水，在保溫箱中加18℃的人工海水，將實驗組大鼠固定于特制鼠籠內，再置于人工海水中浸泡，水位與大鼠胸骨平齊，保持頭部露出水面，以確保大鼠不會誤吸人工海水。在保溫箱中連上水泵和制冷壓縮機，以保持水溫相對恒定。根據分組將大鼠分別浸泡12 h、16 h、20 h、24 h，浸泡1 次后造模結束，造模過程中密切觀察大鼠活動狀態。造模結束后，取存活大鼠的血液和肺組織。血液凝固后離心取上清液，和肺組織一起置于-80℃冰箱保存。0 h 組不做任何處理，直接取材并保存。

4 大鼠肺系數測定 造模前稱大鼠體質量并記錄，造模后取大鼠雙肺組織，在PBS 液中洗去肺組織表面血漬，用濾紙擦干后稱大鼠總肺組織重量。計算各組大鼠肺系數，肺系數=肺濕重(mg)/大鼠體質量(g)。

5 ELISA 檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6 和eCIRP 的含量 eCIRP 的檢測：按說明書稀釋蛋白標準品后，在96 孔板中加入不同濃度標準品，待檢測樣品各100 μL，設置2 個復孔，37℃避光孵育1 h，棄掉孔板內液體后每孔加入工作液A 液100 μL，37℃避光孵育1 h，用配套洗滌液洗板5 次，每孔再加入工作液B 液，37℃避光孵育30 min，洗板，每孔再加入90 μL TMB 底物溶液，37℃避光顯色15 min，后加入50 μL 反應終止液，在酶標儀下測450 nm 吸光度值，并與標準曲線對比，計算出對應濃度。血清IL-1β 和IL-6 的檢測：96 孔板加入標準品和待測樣品100 μL，各設置2 個復孔，37℃避光孵育90 min，洗板后加入生物素化抗體工作液，37℃避光孵育60 min，洗板后加入酶結合工作物，37℃避光孵育30 min，加TMB孵育后終止反應，測450 nm 吸光度值，計算出對應濃度。

6 PCR 檢測大鼠肺組織中CIRPmRNA 的表達水平 稱取大鼠肺組織50 mg，先用Trizol 法提取每只大鼠總RNA，檢測RNA 的純度和濃度，將濃度過高的RNA 進行適當稀釋，使終濃度為100 ～500 ng/μL。按照說明書逆轉錄合成cDNA，并按照試劑盒配置反應體系及設置上機程序進行PCR擴增，以磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)作為內參，測出Ct 值，用2-ΔΔCt計算目的基因CIRP mRNA 表達水平。CIRP 引物上游：GGTGGTGGTAAAGGA CAGG ，下游：CCATCCACAGACTTCCCATTC。GADPH 引物上游：CTGGAGAAACCTGCCAAGT ATG，下游：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT。

7 HE 染色觀察各組大鼠肺組織損傷情況 將固定于4%多聚甲醛中的肺組織制成石蠟切片。將石蠟切片放入二甲苯脫蠟，再用乙醇洗去二甲苯，流水沖洗后用蘇木素染色3 min，沖洗后依次經過分化、返藍處理，再用伊紅染色30 s，依次經過85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯浸泡，中性樹膠封片。普通光學顯微鏡下觀察染色結果，并根據美國胸科協會ALI 的病理評分對切片進行肺損傷評分[19]。

8 TUNEL 染色觀察大鼠肺組織凋亡情況 肺組織切片脫蠟沖洗后，滴加蛋白酶工作液，37℃孵育20 min，PBS 沖洗后加入TUNEL 溶液，37℃孵育1 h，再次PBS 沖洗后滴加TUNEL 溶液室溫孵育20 min，PBS 洗滌后進行DAB 染色，然后用蘇木素復染，再經過不同濃度梯度乙醇脫水、透明、封片，于熒光顯微鏡下觀察。以陽性細胞比例分析并比較各組間大鼠肺組織的差異，陽性細胞比例=陽性細胞數/細胞總數[20]。

9 免疫組化染色觀察iCIRP 在大鼠肺組織的定位及表達 石蠟切片烤片脫蠟復水，然后用含EDTA的檸檬酸抗原修復液修復20 min，再依次經過3%H2O2室溫孵育、封閉液室溫封閉1 h、4℃一抗孵育過夜、二抗室溫孵育30 min，最后DAB 室溫孵育2 ～ 5 min，顯微鏡下觀察，出現棕色顆粒后蒸餾水沖洗3 次，然后用蘇木素染核3 min，PBS清洗后蒸餾水泡5 min，再進行脫水、透明、封片，操作同前，光學顯微鏡下觀察。用ImageJ 軟件分析結果。

10 圖像處理及統計學方法 圖像采用ImageJ 軟件分析，數據采用SPSS 25.0 統計軟件分析，并使用GraphPad 8.0.2 對數據進行可視化處理，服從正態分布的計量資料以±表示，行單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 低體溫肺損傷模型中肺組織病理形態的變化相較于0 h 組，16 h 組(P＜0.05)、20 h 組(P＜0.01)和24 h 組(P＜0.01)大鼠肺系數增加，差異有統計學意義。HE 染色觀察，0 h 組的大鼠肺組織病理結構相對正常，肺泡結構完整，無充血水腫，無炎癥細胞浸潤。12 h 組廣泛可見肺泡壁有彌散的淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，少見肺泡壁輕度增厚；16 h 組可見較多肺泡壁增厚，伴有少量的淋巴細胞與中性粒細胞浸潤；局部肺泡腔與支氣管管腔內可見出血；20 h 組多見肺泡壁增厚，伴有淋巴細胞與少量中性粒細胞浸潤，局部可見輕度出血，多處支氣管管腔內可見嗜酸性黏液分泌，局部可見脫落的上皮細胞；24 h 組可見較大量的肺泡壁增厚，部分肺泡壁破壞，伴有中度的淋巴細胞和中性粒細胞浸潤；少見支氣管管腔內有嗜酸性黏液分泌。對各組HE 染色評分，發現與0 h 組相比，20 h 組(P＜0.05)和24 h 組(P＜0.01)大鼠肺損傷評分顯著增加，差異均有統計學意義。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠肺組織病理表現Fig.1 Pathological manifestations of lung tissues of rats in each group

圖2 各組大鼠肺組織損傷評分和肺系數比較Fig.2 Comparison in rat lung tissue damage score and lung coefficient between different groups

2 大鼠肺組織凋亡情況的變化 在熒光顯微鏡下觀察TUNEL 染色情況，發現與0 h 組相比，各實驗組凋亡細胞比例均有所增加(P＜0.01)，差異均有統計學意義。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠肺組織凋亡情況比較Fig.3 Apoptosis of lung tissue of rats

圖4 各組大鼠肺組織凋亡陽性率比較Fig.4 Comparison in positive rate of apoptosis in lung tissue of rats

3 肺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β 和eCIRP 的表達 ELISA 結果顯示，與0 h 組相比，12 h 組和16 h 組的IL-6、IL-1β 無統計學差異，20 h 組和24 h 組的IL-6 表達水平顯著升高(P＜0.01)； 16 h組(P＜0.05)、20 h 組(P＜0.01)和24 h 組(P＜0.01)IL-1β 增加；12 h 組(P＜0.05)、16 h 組(P＜0.05)、20 h 組(P＜0.05)和24 h 組(P＜0.01) eCIRP 表達升高，差異有統計學意義。相關性分析發現，血清中eCIRP 表達與IL-6 表達呈正相關(r=0.748，P＜0.01)；與IL-1β 表達同樣呈正相關(r=0.770，P＜0.01)。結果提示，在低體溫性ALI 中，eCIRP表達與ALI 嚴重程度有關，eCIRP 的表達越高，IL-6、IL-1β 表達就越高，炎癥程度更嚴重，這提示血清中eCIRP 可作為一種預測ALI 嚴重程度的標志物。見圖5、圖6。

圖5 血清中IL-6 (A)、IL-1β (B)、eCIRP (C)的濃度Fig.5 Concentration of IL-6 (A), IL-1β (B) and eCIRP (C) in serum

圖6 eCIRP 和IL-6、IL-1β 的相關性分析Fig.6 Correlation of eCIRP with IL-6 and IL-1β

4 肺組織中 CIRP mRNA 的表達 我們用qRTPCR 檢測各組大鼠肺組織中CIRP mRNA 表達，結果顯示，與0 h 組相比，12 h 組CIRP mRNA 水平變化不顯著，16 h 組(P＜0.05)、20 h 組(P＜0.05)和24 h 組(P＜0.01) CIRP mRNA 水平升高，差異有統計學意義，這提示大鼠在低溫海水里浸泡16 h后，體內CIRP mRNA 表達開始升高。見圖7。

圖7 肺組織中CIRP mRNA 的表達Fig.7 Expression levels of CIRP mRNA in lung tissue

5 各組大鼠肺組織中iCIRP 定位及蛋白表達情況免疫組化染色中棕黃色顆粒表示iCIRP 陽性，結果顯示，大鼠肺組織中均有棕黃色顆粒沉積，低溫刺激后，棕黃色顆粒表達升高，提示iCIRP蛋白表達水平顯著升高。用H-Score 來評價iCIRP的表達情況，H-Score=∑(pi × i)=(percentage of weak intensity × 1) + (percentage of moderate intensity × 2) +(percentage of strong intensity × 3)[21]，相比0 h 組，24 h 低溫組(t=-5.269，P＜0.01) iCIRP 的表達顯著升高。 見圖8。

圖8 大鼠肺組織中iCIRP 的表達(免疫組化，200×)Fig.8 Expression level of iCIRP in rat lung tissue (IHC, 200×)

討 論

本研究成功建立了低體溫性ALI 大鼠模型，改良了前期課題組的長時程海水浸泡體溫過低癥大鼠模型，通過增加控溫裝置和水循環裝置，保證海水流動和溫度相對恒定，更接近模擬海上遇難者環境。低溫海水浸泡的溫度和時間是建立低體溫性ALI 大鼠模型的關鍵，溫度和時間直接導致大鼠的生理狀態、各系統功能和肺損傷嚴重程度差異。因此，我們通過前期預實驗結果最終選擇18℃為最適合的造模溫度，再進一步探討低溫海水浸泡不同時間肺損傷嚴重程度及其可能機制。

本研究按照浸泡12 h、16 h、20 h、24 h 這4 個時間點構建SD 大鼠低體溫性ALI 模型，觀察肺組織病理結構改變以及血清中IL-6、IL-1β 水平。光鏡下見低溫海水浸泡后的大鼠肺組織出現炎性細胞浸潤、肺泡結構破壞、肺泡間隔增厚、肺出血、肺水腫等表現。細胞因子是機體內具有重要生物活性的小分子蛋白質。其中IL-1β 是一種內源性熱源質，可促進肝細胞合成急性期蛋白，IL-1β 與炎癥、自身免疫性疾病、感染等密切相關。IL-6 通過自分泌和旁分泌形式在局部發揮作用，刺激B 細胞和T 細胞，加速肝細胞急性期蛋白合成，二者共同參與信息傳遞，在免疫應答、組織修復和炎癥反應。本實驗中以IL-6 和IL-1β作為炎癥程度的指標，結果顯示，低溫組大鼠血清中IL-6、IL-1β 水平顯著升高，伴隨低溫浸泡時間增加。既往在LPS、盲腸結扎穿孔等眾多ALI 動物模型中發現細胞凋亡是導致ALI 的病理因素之一，并證實細胞凋亡與肺損傷嚴重程度呈正相關[22]。本研究亦發現在低體溫性ALI 中大鼠肺組織中細胞凋亡不同程度增加，與本課題組以往研究基本一致，證明了低體溫性ALI 造模成功，并提示細胞凋亡與低體溫性ALI 發生有關。通過比較不同時間點實驗組大鼠狀態及肺損傷程度，發現浸泡24 h 時大鼠呼吸微弱，意識狀態模糊，對外界刺激無明顯反應，出現肺損傷且病死率較低，是較為理想的實驗模型。

以往有研究報道iCIRP 在低溫刺激下表達升高[23-24]，低溫條件下iCIRP 介導炎癥因子以mRNA的形式儲存于細胞質中，并可誘導其mRNA 翻譯，加快炎癥因子的產生[25]。而較多研究表明eCIRP 作為一種新發現的DAMP，可以通過TLR4/NF-κB/ICAM1、TLR4/MyD88/STING、TLR4/NF-κB/NLRP3、TREM-1 等通路在不同原因引起的肺損傷發病機制中發揮促炎等作用[13-17,26-27]，但CIRP 在低體溫性ALI 中未見報道，我們擬對CIRP 在肺和外周血中的表達情況進行初步研究和討論。

為了探究CIRP 與低體溫性ALI 的相關性，本研究先是構建大鼠低體溫性ALI 的動物模型，大鼠肺系數和肺病理損傷評分顯示，低溫海水浸泡時間越長，造成的肺損傷越嚴重。相比0 h 組，各實驗組細胞凋亡程度顯著增加，且與低溫海水浸泡時間呈正相關。因此我們推測低溫會導致大鼠肺組損傷，且隨時間延長，其損傷程度加重。與0 h 組相比，各實驗組大鼠血清中的eCIRP水平也隨低溫浸泡時間增加而升高，表明血清eCIRP 與低體溫性ALI 的嚴重程度存在相關性。此外，通過對eCIRP 與IL-6、IL-1β 表達的相關性分析，我們發現實驗組大鼠中eCIRP 與IL-6、IL-1β 的表達呈正相關，表達變化趨勢相同，提示eCIRP 的表達變化與炎癥因子的釋放影響低體溫性ALI 的嚴重程度。因此，本研究充分提示血清eCIRP 可作為一種預測ALI 嚴重程度的標志物。

肺組織mRNA 和蛋白水平CIRP 的表達顯示，與0 h 組相比，16 h 肺組織CIRP mRNA 水平開始升高，24 h 時肺組織iCIRP 蛋白表達顯著升高，而ELISA 結果顯示12 h 時eCIRP 表達升高，血清eCIRP 的增加早于肺組織的CIRP mRNA，這提示血清eCIRP 可能來自于其他組織。本研究從mRNA 水平和蛋白質水平均發現CIRP 的表達升高，并在血清中檢測到eCIRP。這提示CIRP 與低體溫性ALI 具有密切的相關性，對于iCIRP 和eCIRP 如何發揮作用及兩者的相關性不得而知，我們推測這兩者之間可能存在著一定聯系，需要明晰肺組織中iCIRP 與血清中eCIRP 的轉化、轉移關系，肺組織中的iCIRP 是否會釋放到胞外及釋放途徑也值得關注。

綜上所述，本研究證明了CIRP 在低體溫性ALI 中表達升高并發揮一定作用。首先，在大鼠低體溫性ALI 模型中iCIRP 和eCIRP 的表達都有所升高，但二者在低體溫性ALI 中發揮的具體作用仍未闡明。其次，本研究還發現長時間低溫浸泡的大鼠出現了低血容量和低血壓，導致肺組織灌注不足和組織缺氧，前期研究報道缺氧和休克均會引起CIRP 表達上調[14,23,28]，CIRP 表達增加可能還與這些機制有關。總而言之，這些結果均提示CIRP 可能在低體溫性ALI 中發揮重要作用，可以作為低體溫性ALI 的預測分子。CIRP 對低體溫性ALI 的影響作用仍需深入探索，以期未來應用于低體溫性ALI 的臨床診斷。本研究對低體溫性ALI 發生早期的變化特點有了新的認識，為低體溫性ALI 患者的救治策略提供了實驗參考。

作者貢獻徐耀迪：動物實驗，實驗指標檢測，實驗數據分析處理，論文撰寫；王佳新：動物實驗，實驗指標檢測；陳旭昕、張春陽、王凡、丁毅偉：實驗設計與指導；彭聰：實驗數據分析處理；肖漓、韓志海：文章校對及修改。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

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