嘌呤能離子通道型受體7 對小鼠創傷性腦損傷后神經炎癥及腦水腫的影響

陶丙巖，劉羽陽，裴 潔，李 灝，王 惠，彭瑞云，吳海濤，張 軍

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第一醫學中心神經外科，北京 100853；3 安徽醫科大學基礎醫學院，安徽合肥 230032；4 軍事科學院軍事醫學研究院軍事認知與腦科學研究所，北京100850；5 軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是由外傷引起的腦組織結構損傷和功能障礙，具有高發病率、高致殘率和高病死率的特點，對家庭和社會帶來了極大的影響[1]。TBI 包括受傷瞬時造成的原發性損傷和傷后數分鐘后出現并可長期持續存在的繼發性損傷。其中繼發性損傷可引起神經炎癥，導致血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的破壞和血管源性腦水腫的形成，這些并發癥的嚴重程度與患者的預后息息相關[2-5]。嘌呤能離子通道型受體7(purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7R)是一種腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)門控陽離子通道受體，具備促炎、促凋亡等生物學作用[6]。既往研究發現，P2X7R 在腦出血、抑郁癥、帕金森病和阿爾茨海默病等神經系統疾病中發揮著重要作用，與疾病發生后的神經炎癥反應密切相關[7-10]。目前鮮有P2X7R 對TBI 后神經炎癥和腦水腫影響的研究。本實驗基于小鼠TBI 模型以及相關細胞模型，探討P2X7R 對創傷性腦損傷后神經炎癥和腦水腫的作用，挖掘繼發性腦損傷的新治療靶點。

材料與方法

1 實驗材料 LPS 和胰蛋白酶購自美國Sigma 公司，A438079 購自美國MCE 公司，永生化bEnd3小鼠腦微血管內皮細胞系與BV2 小鼠小膠質細胞系購自中國協和細胞庫。一抗IBA1(ab5076)、一抗Claudin-5(ab216327)購自Abcam 公司，一抗P2X7R(28207-1-AP)購自中國武漢三鷹生物技術有限公司，一抗β-actin(4970S)購自美國CST 公司，二抗HRP-Goat anti Rabbit(ab97051)購自Abcam 公司，二抗FITC 標記的熒光二抗(驢抗兔，20015；驢抗羊，20016)購自北京博蕾德生物科技有限公司，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-12 和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA 試劑盒購自中國Elabscience 公司，NLRP3 ELISA 試劑盒購自中國江萊生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司，鏈霉素/青霉素購自美國Hyclone 公司。

2 實驗動物 SPF 級雄性8 ～ 10 周齡C57BL/6J小鼠30 只，體質量20 ～ 26 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠在SPF 條件下飼養在恒溫空調設施中，12 h/12 h 光暗循環，正常進食和飲水。小鼠在適應性喂養5 d 后用于實驗。

3 小鼠創傷性腦損傷造模及分組 小鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后進行左側開顱手術，在前囟及后囟之間距中線2 mm 進行去骨瓣手術，骨瓣直徑3 mm，利用CCI 儀器進行皮質撞擊，打擊參數：打擊速度3.5 m/s，打擊深度1 mm，停留時間500 ms。以隨機數字表法將小鼠分為假手術組、TBI 組、A438079 給藥組，其中假手術組只做開顱去骨瓣手術，不進行打擊；A438079 給藥組在CCI 造模后1 h、24 h 和48 h 分別腹腔注射A438079 (80 mg/kg)。各組小鼠均在72 h 時被處死，取腦組織行相關檢查。

4 焦油紫染色觀察腦組織大體形態 腦片經PBS 清洗后浸泡焦油紫20 min，之后75%、95%、無水乙醇依次脫水約2 min，二甲苯透明，滴加中性樹脂封片。

5 腦組織免疫熒光觀察小膠質細胞形態、數量及P2X7R 含量 處死小鼠后取腦，切片，取損傷部位(左側海馬上方皮質)的冠狀腦片，PBS 清洗3 次，0.3% PBST 室溫孵育15 min，PBS 再次清洗3 次；封閉液(含3%牛血清白蛋白的PBS)室溫孵育1 h，抗IBA1(1：500)和P2X7R(1：400)抗體4℃孵育過夜；次日PBS 清洗3 次；FITC 標記的熒光二抗(驢抗羊，1：500；驢抗兔，1：500)37℃避光孵育1 h，用含有DAPI 的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

6 熒光共定位分析觀察P2X7R 與小膠質細胞的共定位程度 使用ImageJ(1.53c)進行共定位分析，Split channel 將熒光圖片拆分為單色通道，使用Colocalization Threshold，在Channel1 和Channel2上選擇IBA1 和P2X7R 兩個顏色通道，其他參數選擇默認設置并獲取結果報告。

7 BV2 細胞培養及實驗分組 用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 培養基孵育BV2 細胞于5% CO2、37℃的恒溫培養箱中。換液1 次/2 d，當細胞密度達到80%時進行傳代。BV2 細胞實驗分為對照組、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組、A438079[11](P2X7R 的特異性抑制劑)給藥組；其中A438079 給藥組在LPS 處理1 h 后加入A438079。LPS 處理濃度為1 μg/mL，A438079 處理濃度為10 μmol/L，藥物處理時間為24 h。

8 BV2 條件培養基的制備及應用 BV2 細胞加藥處理24 h 后，棄掉原培養基，PBS 清洗2 次，加入無血清培養基。孵育48 h 收集BV2 細胞上清液。在4℃下200 g 離心15 min，棄沉淀。上清液用0.45 μm 過濾器過濾后所得濾液即為BV2 細胞的條件培養基。將各組BV2 細胞的條件培養基加入bEnd3 細胞中，孵育48 h 后收樣。

9 ELISA 實驗檢測IL-1β、IL-6、IL-12 和TNF-α的含量 取BV2 細胞上清液，4℃下1 000 g 離心20 min，按照試劑盒的操作說明書操作，使用酶標儀于450 nm 波長處檢測各組IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α 的吸光度，每組3 個復孔，根據標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各組細胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-12 和TNF-α 的濃度值。

10 Western blot 檢測P2X7R 及緊密連接蛋白Claudin-5 蛋白表達量 蛋白提取后，用BCA 法測定蛋白濃度，上樣，電泳，轉膜，封閉1 h 后孵育相應一抗過夜：兔抗P2X7R 抗體(1∶1 000)，兔抗β-actin 抗體(1∶1 000)，兔抗Claudin-5 抗體(1∶1 000)。用TBST 漂洗PVDF 膜4 次，加入HRP 標記的山羊抗兔(1∶5 000)二抗室溫孵育1 h，再用TBST 漂洗后采用化學增強發光法進行顯色。

11 小鼠腦組織含水量測定 采用干濕重法計算腦組織含水量，小鼠TBI 建模后第3 天，麻醉，斷頭取腦，迅速將大腦分為左右半球，稱取濕重后放入100℃烤箱中烘烤24 h，再次稱重，即為干重。通過腦組織含水量計算公式算出腦組織含水量，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重 × 100%。

12 統計學方法 使用GraphPad Prism 9.0 進行統計和作圖，經Shapiro-Wilk test 正態性檢驗，所有數據符合正態分布以±表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間差異比較采用Tukey 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義，所有實驗均獨立重復3 次。

結 果

1 腦組織免疫熒光觀察小鼠小膠質細胞形態、數量及P2X7R 含量 與假手術組相比，模型組損傷周圍區域的小膠質細胞數量顯著增多(P＜0.001)，且細胞胞體明顯增大，形態呈阿米巴樣，提示TBI 后小膠質細胞從靜息態活化為激活態；相較于假手術組，模型組中損傷周圍區域的P2X7R 表達量顯著增多。見圖1。

圖1 假手術組與TBI 組小鼠腦組織大體形態及兩組小膠質細胞、P2X7R 表達Fig.1 Gross morphology of brain tissue and expression of microglia and P2X7R in sham operation group and TBI group

2 熒光共定位分析觀察P2X7R 與小膠質細胞的共定位程度 使用ImageJ 進行共定位分析發現P2X7R 與IBA1 共定位明顯(Rcoloc=0.852 4)，提示P2X7R 在小膠質細胞中表達。見圖2。

圖2 小鼠腦組織P2X7R 與小膠質細胞共定位Fig.2 P2X7R was co-localized with microglia in mice brain

3 Western blot 法測定BV2 細胞P2X7R 蛋白表達 與對照組比較，LPS 組BV2 細胞中的P2X7R蛋白表達增加(P＜0.000 1)。見圖3。

圖3 對照組與LPS 組BV2 細胞P2X7R 蛋白表達Fig.3 Expression level of P2X7R protein in BV2 cells of the control group and the LPS group

4 各組BV2 細胞上清液炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-12 和TNF-α 的表達水平 與對照組相比，LPS組IL-1β、IL-6、IL-12 和TNF-α 表達含量顯著增加(P＜0.000 1)。相較于LPS 組，A4388079 給藥組IL-1β、IL-6、IL-12 和TNF-α 表達含量顯著降低(P＜0.01)。見圖4。

圖4 各組BV2 細胞上清液IL-1β、IL-6、IL-12 及TNF-α 表達量Fig.4 Expression levels of IL-1β, IL-6, IL-12 and TNF-α in the supernatant of BV2 cells in each group

5 Western blot 法測定bEnd3 細胞緊密連接蛋白Claudin-5 蛋白表達 在條件培養基孵育后的bEnd3細胞中，相比于對照組，LPS 組的Claudin-5 緊密連接蛋白表達量顯著降低(P＜0.000 1)；與LPS 組相比，A438079 給藥組的Claudin-5 緊密連接蛋白表達量顯著增加(P＜0.01)。提示抑制P2X7R 可緩解損傷導致的緊密連接蛋白的破壞程度，P2X7R可能在創傷性腦損傷后破壞血腦屏障的完整性中發揮重要作用。見圖5。

圖5 各組bEnd3 細胞緊密連接蛋白Claudin-5 蛋白表達Fig.5 Expression level of Claudin-5 protein in bEnd3 cells in each group

6 各組小鼠腦組織含水量比較 TBI 3 d 后，TBI組腦干濕重比(腦含水量)顯著增加，與假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.001)；相比TBI 組，A438079 給藥組的腦含水量顯著降低(P＜0.05)，提示P2X7R 的抑制有利于降低TBI 后小鼠的腦水腫程度。見圖6。

圖6 各組小鼠腦組織含水量比較Fig.6 Comparison of brain water content in each group

討 論

TBI 的原發性腦損傷瞬時發生，難以及時實施干預，而對于繼發性腦損傷有寶貴的時間窗采取治療措施，因此繼發性腦損傷是創傷性腦損傷治療干預的關鍵，而神經炎癥是其核心特征[12]。越來越多的研究發現P2X7R 可能與中樞神經系統炎癥性疾病密切相關，Zhao 等[7]研究發現，抑制P2X7R 可以減輕腦出血后1 d 的腦水腫、小膠質細胞積累和神經功能障礙。Chai 等[13]研究發現，紅景天苷可能通過抑制P2X7R 發揮抗抑郁作用。然而目前鮮有研究探索P2X7R 與TBI 后神經炎癥和腦水腫之間的相關性。

小膠質細胞是神經系統中主要的免疫細胞，被認為在創傷性腦損傷中發揮著重要作用[14]。在正常情況下，小膠質細胞主要起到免疫監視周圍微環境中異常組分和有害刺激的作用，而在TBI后，小膠質細胞被激活，從而釋放大量的炎癥因子，與TBI 后的神經炎癥反應密切相關[15-18]。IBA1 是小膠質細胞的特異性標志物之一，故本實驗通過IBA1 觀察小膠質細胞的改變，相較于假手術組，TBI 組小鼠小膠質細胞數量增加且小膠質細胞被明顯激活，并伴隨P2X7R 數量增多；且在細胞Western blot 實驗中亦發現LPS 處理后BV2 細胞的P2X7R 表達量增多，體外體內實驗均說明TBI 后小膠質細胞上的P2X7R 表達增多，提示其可能在TBI 中扮演著重要角色。共定位分析顯示，TBI 后IBA1 與P2X7R 的Rcoloc 值＞0.8，提示P2X7R 在小膠質細胞中表達，這與既往研究報道一致[19]。而ELISA 結果提示，LPS 處理后，BV2 細胞分泌的IL-1β、IL-6、IL-12 和TNF-α 等炎癥因子顯著增多，而抑制P2X7R 后各種炎癥因子含量顯著降低，炎癥反應顯著緩解，說明P2X7R 能夠調控TBI 后神經炎癥反應的發生發展。

此外，腦水腫也是繼發性腦損傷非常重要的影響因素，腦水腫主要分為血管源性腦水腫、細胞毒性腦水腫、間質性腦水腫和滲透性腦水腫，研究發現TBI 后急性期的腦水腫主要是血管源性腦水腫，其特征為BBB 通透性增加，大量液體和血管內蛋白質積聚于腦白質細胞間隙[20]。故本實驗通過小鼠腦干濕重比檢測各組小鼠腦組織的含水量，觀察TBI 造模及抑制P2X7R 后對小鼠創傷后腦水腫程度的影響，結果發現TBI 組小鼠腦水腫程度相比假手術組顯著升高，而抑制P2X7R 可以顯著緩解小鼠TBI 后的腦水腫程度。條件培養基處理的bEnd3 的Western blot 結果亦提示LPS處理后小膠質細胞會導致內皮細胞緊密連接蛋白表達減少，而抑制P2X7R 可以逆轉LPS 導致的緊密連接蛋白的表達變化，動物和細胞實驗結果均提示P2X7R 在TBI 后腦水腫的發生發展過程中發揮著重要作用。

綜上所述，本研究提示TBI 后P2X7R 在小膠質細胞中表達增多，創傷性腦損傷后P2X7R 的激活在小鼠TBI 后神經炎癥和腦水腫的發生發展過程中發揮著重要作用，抑制P2X7R 可以顯著減輕神經炎癥反應及腦水腫程度，但P2X7R 調控TBI 后神經炎癥和腦水腫程度的具體作用機制仍有待進一步研究。

作者貢獻陶丙巖：細胞培養，動物飼養，實驗指標檢測，實驗數據分析處理，論文撰寫；劉羽陽、裴潔：細胞培養，動物飼養；李灝：實驗數據分析處理；王惠、彭瑞云、吳海濤：文章校對；張軍：實驗設計，文章校對。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本篇論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：TBYneuro2020@foxmail.com。