澤蘭素緩解丙泊酚誘導的小鼠海馬組織損傷的作用機制

周進國，白麗梅

（1.邯鄲市第一醫院麻醉科，河北 邯鄲 056000；2.邯鄲市第一醫院東區急診內科，河北 邯鄲 056000）

丙泊酚具備促使神經元無序凋亡、抑制增殖等神經毒性，過量使用可引起海馬組織損傷，并誘發認知功能障礙[1]。神經炎癥、缺血再灌注損傷、氧自由基超載和TNF- /NF- B炎性因子異常激活等導致的神經細胞凋亡被公認為海馬損傷病理過程的關鍵調控機制[2]，因此抑制缺血再灌注損傷及阻滯TNF- /NF- B 炎性因子表達成為治療及預防丙泊酚麻醉損傷導致神經元受損保護的思路之一。

澤蘭植物為唇形科地筍屬植物毛葉地瓜兒苗（Lycopus lucidus Turcz.var. hirtus Regel）及地瓜兒苗（Lycopus lucidus Turcz.）莖上植物部分，毛葉地瓜兒苗的莖、苗、花和葉部分被收錄于2010 年版《中國藥典》（一部），被廣泛用于活血調經，祛瘀消癰，利水消腫等方面；現代藥理藥學認為其具備抗凝血、活血化瘀、增加膽汁含量、熊去氧膽酸量、清除二苯代苦味酰肼和超氧陰離子自由基能力、兼具還原Fe3+能力及抑制脂質過氧化能力[3]。

研究表明，澤蘭提取物具備調控PI3K/Akt 信號通路，下調HIF-1a 基因表達及其下游蛋白表達[4]，有效緩解急性缺氧導致的局灶性腦組織缺血損傷[5]，澤蘭素可能在其中發揮關鍵作用，然而在丙泊酚麻醉損傷后腦神經保護與TNF- /NF- B 通路間的調節關系尚未被完全闡釋。因此，該研究擬建立丙泊酚麻醉誘導的小鼠海馬組織損傷模型，解析澤蘭素對丙泊酚誘導的C57 小鼠海馬神經細胞損傷及TNF- /NF- B 信號通路的關聯機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物準備

SPF 級健康C57 小鼠，體質量35.0~70.0 g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司，動物許可證號：SYXK（京）2021-006。喂養環境：溫度22.0~25.0 ℃，濕度45.0%~60.0%，光照12 h/陰暗12 h 循環。

1.2 試驗耗材及儀器

澤蘭素水提物532-48-9（CAS：YT70340，濃度為10.0%）購自北京伊塔生物科技有限公司；3-N-丁苯酞6066-49-5（貨號：ESSMB00312, CAS：6066-49-5，規格：100mg）購自香港吉斯恩貝國際貿易有限公司；Mouse TNF- ELISA Kit [小鼠腫瘤壞死因子（TNF- ）ELISA 試劑盒（貨號：70-EK282/3）]購自聯科生物；小鼠核因子B 亞基p65（NF- B p65）ELISA 試劑盒（批號：EK-R37440）購自上海酶研生物科技有限公司；BDNF ELISA 試劑盒（批號：l110740）購自上海貝諾生物科技有限公司。

奧盛Feyond-A300 多功能酶聯免疫分析儀（杭州奧盛）；Chemi-Doc XRS 型化學發光成像系統（Chemi Doc XRS+，BIO-RAD）。

1.3 試驗方法

C57 成年小鼠60 只隨機數法隨機分組，丁苯酞陽性藥物對照組（Dl-3-N-Butylphthalide，丁苯酞組，n=40）、澤蘭素給藥組（澤蘭素組，n=40）和海馬損傷模型組（模型組，n=40），通過50 mg/kg丙泊酚腹腔旋轉注射方式誘導C57 成年小鼠海馬組織腦損傷模型，依據已發表文獻[4]的造模成功標準，試驗鼠全部成功制備丙泊酚誘導海馬損傷模型。另選取同批次小鼠作為空白對照組（空白組，n=40）。丁苯酞組、澤蘭素組、模型組和空白組以腹腔旋轉注射方式分別給予2 mg/kg丁苯酞、1.24 mL/kg 自備澤蘭素混懸液1 mL、0.9%生理鹽水1 mL和0.9%生理鹽水1 mL，1 次/d，持續28 d。第29 天采用頸動脈脫臼法處死全部試驗小鼠，剝離雙側腦實質組織，參照Shi 的方法[6]，ELISA 方法檢測干預前及試驗開始第28 天測定腦實質的TNF- /NF- B、BDNF 表達。

HE 染色，取試驗鼠雙側腦實質組織于10.0%福爾馬林液體中行酒精脫水、石蠟包埋，冠狀切面取片，選擇典型海馬組織切片行脫蠟、水化及Nissl 染色液浸染30 min 后漂洗，100%pH=7.030 中性樹膠后封閉10 min 后行纖維切片。

各組小鼠干預前、試驗開始第28 天分別行水迷宮試驗、神經功能評分和糖水偏好試驗。水迷宮試驗，設置室內平均噪聲數低于25 分貝，隨機選取4 處不同象限等間隔池壁入水點，各組小鼠分別獨立依次從入水點放置，記錄3 min內平臺尋找時間、靜置平臺穿越頻次，訓練4 d，每天2 次，限定時間為2 min，訓練間隔10min，記錄逃避潛伏時長、對側象限停留時間（s）和穿越初始平臺頻次。神經功能評分：依據Masso Shmiizu-Sasamata評價方法，在干預前、試驗開始第28天兩個時間節點依據動物神經行為記錄神經損傷嚴重缺損評分。糖水偏好試驗：在規定時間節點內對試驗小鼠進行糖水偏好試驗，分別給予每只試驗小鼠1 瓶無菌蒸餾水和1 瓶質量分數為2.0%蔗糖溶液，24 h 后分別計算無菌蒸餾水及蔗糖溶液減少質量，統計小鼠糖水偏好指標。糖水偏好指標= 蔗糖水減少量/（蔗糖水減少量+無菌蒸餾水減少量） 100%。

1.4 觀察指標

Nissl染色法檢測大鼠海馬組織神經元損傷程度；神經功能評分、Morris 水迷宮試驗和糖水偏好試驗3種試驗方式檢測干預前后神經 行為變化；ELISA 方法比較TNF- /NF- B、BNDF 水平。

1.5 統計學方案

所有數據采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗，雙尾檢驗，以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色檢測小鼠海馬組織神經元損傷

澤蘭素組、丁苯酞組和空白組大鼠神經元結構相對完整，邊緣界限明確清晰，神經元突觸圓潤飽滿，細胞核位于中央；模型組損傷處神經元皺起，邊緣界限不清，組織紋理及結構紊亂，見圖1。

圖1 海馬組織切片形態圖（HE 染色，200 ）Fig.1 Morphological map of hippocampal tissue sections (HE staining,200 )

圖2 各組糖水偏好試驗指數變化百分比Fig.2 Percentage change in sugar preference test index by group

2.2 各組干預前后水迷宮試驗指標變化

Morris水迷宮結果提示：與空白組比較，模型組單位逃避時間、對側象限停留時間顯著延長（P＜0.05）；澤蘭素組、丁苯酞組單位逃避時間、對側象限停留時間顯著縮短（P ＜0.05）。模型組穿越初始平臺頻次顯著減少，澤蘭素組、丁苯酞組顯著增加（P ＜0.05）。與模型組比較，澤蘭素組、丁苯酞組單位逃避時間、對側象限停留時間顯著縮短、穿越初始平臺頻次明顯增加（P＜0.05），見表1。

表1 各組干預前后水迷宮試驗指標變化（n=40）Table 1 Changes in water maze experimental indicators before and after intervention in each group

2.3 各組干預前后模型組神經功能評分變化

與試驗前相比，試驗后澤蘭素組、丁苯酞組神經功能缺損程度評分明顯下降（P ＜0.05）；模型組評分比較則無明顯差異（P ＞0.05）。試驗后Masao Shmiizu-Sasamata 神經功能評分比較中發現，與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組評分下降，差異顯著（P ＜0.05），見表2。

表2 各組神經功能評分干預前后的變化（n=40）Table 2 Changes of neurological function scores in each group before and after intervention

2.4 各組干預前后糖水偏好試驗評價

與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組糖水偏好試驗指數明顯上升，差異（P＜0.05）。與陽性藥物丁苯酞組相比，澤蘭素組糖水偏好試驗指數略顯降低，但差異不顯著（P ＞0.05）。

2.5 ELISA檢驗TNF- /NF- B、BNDF水平

表3 結果顯示，與空白組相比，澤蘭素組、丁苯酞組NF- B、BNDF 明顯上升，TNF- 明顯下降，差異極顯著（P ＜0.01）；與模型組相比，澤蘭素組、丁苯酞組NF- B、BNDF明顯上升，TNF- 明顯下降，差異顯著（P＜0.05）。

表3 ELISA 檢驗TNF- ，NF- B 和BNDF 的表達水平（n=40）Table 3 Detection of expression level of TNF- ,NF- B and BNDF by ELISA

3 討論

過量丙泊酚可過度激活海馬CA1 區谷氨酸受體導致調控功能障礙[7,8]，可導致空間認知功能障礙及可逆性記憶減退。澤蘭水提取物能減輕神經元細胞氧化應激、自由基超載和抑制炎癥因子表達，減少神經元缺血再灌注損傷等作用，其分子機制之一為促進PI3K/Akt Pathway 及其下游HIF-1a 從而發揮拮抗ROS 等因子表達[9-11]，因此，澤蘭素理論上具備延緩丙泊酚海馬CA1 區受體損傷的作用，然而機制尚未探明。研究表明，NF- B 作為Rel 蛋白家族內多向性轉錄調節，是TLR4/MyD88信號通路調控節點，可發揮轉錄IL-1 、IL-8 和TNF- 調控，激活炎癥因子表達，并抑制神經元細胞炎癥凋亡[12-14]；TNF- 可降低海馬神經元突觸間傳遞效率[15]，增強TNF- 受體疼痛遺忘效應并降低突觸可塑性[16]；BDNF 可作為腦神經元神經保護的功能性指標之一，具備維持神經元突觸塑造、調控分化及神經電生理損傷后再修復等功能，反應海馬組織丙泊酚類化學藥物損傷再修復程度[17-20]。

海馬麻醉損傷往往導致快感喪失，經典糖水偏好試驗常用作衡量海馬受損抑郁狀態程度的重要指標之一。本研究通過對海馬損傷模型小鼠進行丙泊酚麻醉處理方式建立海馬麻醉損傷模型，使用陽性對照藥物丁苯酞、澤蘭素對模型鼠進行試驗。Morris水迷宮檢測結果顯示，澤蘭素組單位逃避時間、對側象限停留時間顯著縮短和穿越初始平臺頻次明顯增加，這表明澤蘭素提高了空間記憶鞏固能力及記憶提取的精確性。糖水偏好試驗則證實，澤蘭素可有效增強對抗抑郁行為，緩解海馬損傷大鼠認知功能的受損。

澤蘭素可使腦海馬組織內TNF- 、BNDF 表達升高，NF- B 表達降低，此項結果表明，澤蘭素在增強突觸傳遞效率、腦神經保護及TNF 受體調控突觸可塑性方面具備一定效應，驗證了澤蘭素對丙泊酚藥物麻醉損傷海馬功能的保護作用。

澤蘭素可顯著上調NF- B、BNDF 蛋白表達，抑制TNF- 合成和釋放，增強神經元功能恢復，強化小鼠的空間規劃及瞬時記憶能力，協助抗抑郁，以緩解小鼠丙泊酚誘導的海馬組織損傷。