基于網絡藥理學與分子對接探討火把花根干預IgA 腎病的作用機制研究

鐘秀玉，張建

（1.河南中醫藥大學兒科醫學院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450000）

IgA 腎病（IgA nephropathy, IgAN）是指腎小球系膜區以IgA 或IgA 為主的免疫復合物沉積為主要特點的腎小球疾病，是目前世界范圍內最常見的原發性腎小球疾病，亦是CKD 和腎衰竭的首要病因之一，約25%~30%的患者在20~25 年內可緩慢進展至腎衰竭[1]。IgAN發病有著明顯的地域差異，亞洲國家的發病率明顯高于歐洲、美洲、非洲等國家，我國經腎活檢確診的IgAN 占原發性腎小球疾病的45%以上[2]。雖然IgAN在人群中有著較高的發病率，但目前我們對其發病機制的認識仍十分有限，以至于針對IgAN 尚缺乏特異性的治療方法，現以RAS 抑制、嚴格控制血壓等支持治療為主。因此，積極探索IgAN 的發病機制并尋找切實有效的治療方法顯得尤為重要。

火把花[Tripterygium hypoglaucm(Levl.)Hutch]為衛矛科雷公藤屬植物，又名昆明山海棠、斷腸草、紫金皮等，是中成藥火把花根片的主要藥源。火把花根片由“昆明山海棠”去皮的根芯加工而成，有祛風除濕、舒筋活絡、清熱解毒等功效。同雷公藤屬植物雷公藤一樣，屬于中藥免疫抑制劑，臨床廣泛應用于各種腎小球疾病，大量研究顯示，火把花根片能有效控制蛋白尿、改善腎功能[3-6]。現代藥學研究顯示，火把花根含有生物堿、萜類、皂苷、內酯、色素等多種化學成分。藥理實驗證明，該植物具有抗炎、抗生育、免疫抑制、抗癌、鎮痛等作用[7-9]。但目前就其干預IgAN 的作用機制尚不完全清楚。

網絡藥理學（Network pharmacology,NP）由Andrew L.Hopkins 教授于2007 年首次提出，有別于傳統藥理學研究模式，網絡藥理學基于系統生物學和生物網絡的構建，揭示了藥物與疾病之間多靶點、多途徑、多通路的分子機制[10,11]。這一概念與傳統中醫藥學的“整體觀念”、“辨證論治”和“方劑干預”原則不謀而合，國內李梢教授從生物分子網絡角度出發，自主研制了一套中藥網絡藥理學研究方法，先后闡釋了中醫證候、方藥的微觀生物網絡及作用機制[12]。目前網絡藥理學已成為中醫藥現代化研究的重要且成熟的方法及理論。基于計算機模擬技術進行的分子對接操作，能夠預測配體與生物大分子之間的相互作用模式，并評估兩分子之間的結合，是藥物研發過程中重要的虛擬篩選途徑[13,14]。本研究正是基于網絡藥理學及分子對接技術，從分子水平探討火把花根干預IgAN 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 火把花根相關成分及靶點預測

綜合檢索相關文獻并收集火把花根化合物成分及結構信息，利用Pubchem 數據庫下載化合物結構式或直接參照文獻中化學結構式利用Chemdraw 畫出，結構式均以sdf 格式保存。將所獲得的分子結構式輸入SwissADME平臺[15（]http://www.swissadme.ch） 進行類藥性篩選，核心化合物篩選標準設置為：①腸胃吸收（Gatrointestinal absortion；GIabsortion）為“High”，表明該成分具備良好口服生物利用度；②設置5 類藥性預測（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）結果中有2個及2 個以上為“Yes”，表明該化合物具有較佳的藥代動力學特征。其中不符合篩選標準的化合物，進行文獻查閱核查，若化合物藥理作用明顯與研究主題相關，仍予以納入，最終獲得火把花根潛在核心化合物。然后利用Pharmmapper數據庫[16（]http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）基于藥效團映射進行靶點預測，并選擇Normalized Fit Score（NF）≥0.5 的蛋白作為藥物預測靶點。

1.2 IgAN疾病靶點預測

利用GeneCards數據庫[17（]https://www.genecards.org/）、DisGeNet數據庫[18（]https://www.disgenet.org/）、OMIM數據庫[19（]Online Mendelian Inheritance in Man）（https://www.omim.org/）、DRUGBANK 數據庫[20]（https://go.drugbank.com/），以“IgA nephropathy”、“IgAN”為檢索詞進行檢索獲取IgAN 相關疾病靶點。將獲取的疾病靶點匯總并刪除重復值。利用Uniprot數據庫將預測到的藥物和疾病靶點名稱統一規范為Genesymbol，通過R4.2.0ggvenn包對火把花根與IgAN相關靶點進行交互映射，最終獲得火把花根干預IgAN的潛在靶點。

1.3 火把花根成分-IgAN靶點PPI網絡構建

蛋白交互作用網絡（Protein-protein interactions,PPIs）的構建旨在透過蛋白質交互作用從分子生物學角度闡釋蛋白質在細胞中的生化功能。將“火把花根”“IgAN”共同靶點上傳至STRING11.5 數據庫[21]（https://stringdb.org/），選擇“智人”物種，并將蛋白互作關系置信分數設置為中等置信度（score≥0.4），以獲得PPI 網絡。利用Cytoscape 3.9.0 軟件[22]對PPI 網絡圖進行分析，并使用cytohubba 插件[23]、MCODE 插件[24]篩選核心靶點及子網絡。

1.4 火把花根成分-IgAN靶點GO、KEGG生物富集分析

利用R4.2.0 clusterProfiler 包[25]基于org.Hs.eg.db注釋包及KEGG在線數據庫注釋（https://www.genome.jp/kegg/）對交集靶點進行GO（Gene Ontology）與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）生物富集分析及功能注釋，其中GO 注釋包括生物學過程（Biological process,BP）、細胞組分（Cellular component, CC）與分子功能（Molecular function, MF）。根據矯正后p 值（p.adjust）從小到大進行排序，最終選取排在前10 位的富集結果。

1.5 火把花根成分-靶點網絡圖構建

將火把花根單體成分與火把花-IgAN相關靶點進行匹配，上傳至Cytoscape 3.9.0 構建成分-靶點信息網絡圖。利用軟件內置工具“Analyze Network”對網絡進行分析并獲得相關網絡拓撲參數值，包括節點的度（Degree）、接近度（Closeness）、介數（Betweenness）等，以用來尋找網絡中重要的成分及靶點信息。

1.6 分子對接評估

對“1.5”項下獲得的核心成分和靶點（Degree值排名前六）進行分子對接。利用pubchem、Chem3D 20.0優化（結合能最小化）并保存核心成分3D 結構（mol2格式）；利用RCSB PDB 數據庫[26（]https://www.rcsb.org/）下載核心受體蛋白晶體結構（pdb 格式）。使用AutoDockTools 1.5.7 對受體蛋白進行加氫、計算原子局部電荷、判斷原子類型的處理，并對小分子配體加氫、計算局部電荷（Partial charges）、設置可旋轉配體鍵；最后將處理后的配體、受體結構保存為pdbqt 格式。使用AutoDock Vina 1.1.2[27]執行分子對接預測，依據對接結果中Affinity 值評估小分子配體與受體蛋白的結合情況。

2 結果

2.1 火把花根主要活性成分及靶點預測結果

以“火把花”、“昆明山海棠”、“成分”為關鍵詞通過知網進行檢索，閱讀整理相關文獻[28-31]，最終共獲得43 個與火把花根相關的化合物成分信息，包括“雷公藤晉堿”、“雷公藤春堿”等生物堿類；“雷公藤甲素”、“雷藤二萜醌A”等二萜類；“雷公藤紅素”、“雷公藤內酯甲”等三萜類以及其他黃酮類、糖苷類、脂肪酸類等成分。根據類藥性原則通過SwissADME 平臺共篩選出19 種潛在活性成分（表1），部分成分結構式見圖1。利用PharmMapper 數據庫預測并選擇NF≥0.5 的靶蛋白作為成分靶點，匯總并去除所有重復值，最終共篩選出285 個藥物靶點。

表1 火把花根潛在活性成分Table 1 Potential active ingredients of the Tripteryium hypoglaucum root

圖1 部分化合物結構式Fig.1 Structural formula of some compounds

2.2 火把花根干預IgAN潛在靶點獲取

以“IgA nephropathy”、“IgAN”為檢索詞進行檢索，在Genecards 數據庫、OMIM 數據庫、Disgenet 數據庫、Drugbank 數據庫中分別獲得647 個、178 個、458 個、20 個疾病相關靶點。整合各數據庫所獲靶點，合并匯總并刪除重復值，最終共得到937 個與IgAN相關的疾病靶點。利用R4.2.0ggvenn 包對285 個火把花根中藥靶點與937 個IgAN 疾病靶點進行交互映射，獲得54 個中藥疾病共同靶點，并繪制VENN圖，見圖2。

圖2 藥物靶點和疾病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of drug targets and disease targets

2.3 PPI網絡構建

將54 個共同靶點上傳至STRING11.5 數據庫建立蛋白互作網絡圖，并導入Cytoscape 3.9.0 利用Analyze Network 工具計算網絡拓撲參數，依據節點度值（Degree）及邊的結合分數（Combined score）對PPI 網絡進行調整最終得到蛋白互作網絡圖（圖3），其中節點顏色越深、面積越大、透明度越高，其degree 越大，邊的顏色越深、寬度越大、透明度越高，其combined score 越大，二者均表明該節點在網絡中更重要。利用cytohubba 插件依據MCC 算法篩選排名前十的核心靶點（表2），利用MCODE 插件對PPI 網絡進一步分析，篩選保存核心子網絡，見圖4。

表2 火把花根-IgAN“MCC”評分排名前十的核心靶點Table 2 Top ten core targets of Tripterygium hypoglaucum Root-IgAN"MCC"score

圖3 火把花根-IgAN 靶點PPI 網絡Fig.3 Tripterygium hypoglaucum Root-IgAN target PPI network

圖4 火把花根-IgAN 靶點PPI 網絡中的子網絡模塊Fig.4 The module in the Tripterygium hypoglaucum Root-IgAN target PPI network

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集

利用R4.2.0 clusterProfiler 程序包對火把花根干預IgAN 靶點進行生物信息富集分析及功能注釋，見圖5。GO 富集結果顯示潛在靶點主要參與傷口愈合（Wound healing）、激素代謝過程（Hormone metabolic process）、白細胞黏附（Leukocyte cell-cell adhesion）等生物進程；主要定位在囊泡腔（Vesicle lumen）、分泌顆粒管腔（Secretory granule lumen）、血小板 顆粒（Platelet alpha granule）等細胞結構上；主要的分子功能涉及肽酶活性（Peptidase activity）、絲氨酸水解酶活性（Serine hydrolase activity）、磷酸酶結合（Phosphatase binding）等。KEGG通路主要富集癌癥中的蛋白聚糖信號通路（Proteoglycans in cancer pathway）、脂質和動脈粥樣硬化信號通路（Lipid and atherosclerosis pathway）、FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）等。

圖5 火把花根干預IgAN 潛在靶點富集分析Fig.5 Enrichment analysis of potential targets of Tripterygium hypoglaucum roots intervention in IgAN

2.5 火把花根成分-靶點網絡構建

利用Cytoscape3.9.0 構建火把花根成分與靶點信息網絡圖，并根據網絡拓撲學參數獲得核心成分及靶點信息。如圖6 所示，該網絡共包含73 個節點、485 條邊，節點面積越大、顏色越深代表度值（Degree）越高，即該成分、靶點在網絡中越重要。其中雷公藤內酯甲、雷公藤春堿、雷公藤內酯乙、雷公藤紅素等為火把花根干預IgAN 的核心成分；周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、醛糖還原酶（AKR1B1）、凝血酶（F2）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等為潛在的核心靶點。

圖6 火把花根干預IgAN 成分-靶點網絡圖Fig.6Tripterygium hypoglaucum roots interferes with IgAN components-target network diagram

2.6 分子對接結果

利用AutoDock Vina 對“1.5”項下degree 值排名前6的核心成分（wilforlide A、wilfortrine、wilforlide B、Celastrol、triptobenzene H、wilforgine）及靶點CDK2（PDBID：1gz8）、AKR1B1（PDBID：1us0）、F2（PDBID：3po1）、MAPK14（PDBID：2zaz）、TTR（PDBID：1f41）、ALB（PDBID：1n5u）進行分子對接計算，并根據對接評分Affinity 對結合力進行評估，其中Affinity ＞ 16.7 kJ/mol提示結合力極弱或認為無結合； 29.302 kJ/mol ＜Affinity≤ 16.7 kJ/mol 提示結合力中等；Affinity≤29.3 kJ/mol 提示結合力較強。對接結果顯示小分子配體和受體蛋白共36 種組合（圖7），Affinity 值均＜16.7 kJ/mol，最大值為 23.0 kJ/mol，表明核心成分與受體蛋白有著較好的結合力。其中wilforlideA與AKR1B1結合力最強（Affinity = 54.8 kJ/mol），具體對接模式見圖8。如圖所示，wilforlide A 與AKR1B1 氨基酸殘基通過范德華力相互作用，此外與AKR1B1 氨基酸殘基LEU195、LYS194 均形成alkyl 相互作用。其余結合力較強的還有triptobenzene H 和AKR1B1、Celastrol和MAPK14 等。

圖7 分子對接結果Fig.7 Molecular docking result

圖8 Wilforlide A 與AKR1B1 對接模式Fig.8 Wilforlide A and AKR1B1 docking mode

3 討論

IgAN 是臨床常見的原發性腎小球疾病，根據臨床表現歸屬于中醫“尿血”、“尿濁”和“腎風”等范疇。現代醫學研究顯示IgAN 的發病乃多重因素相互作用的結果，患者在遺傳易感基因存在的背景下，機體IgA1分子糖基化異常、IgA 清除水平下降，導致pIgA1 及IgA1-免疫復合物（IgA1-IC）形成并沉積于腎小球系膜區，激活補體系統、引發炎癥反應及纖維化形成。研究顯示[9]火把花根具有明顯的免疫抑制及抗炎作用，臨床被廣泛用于包括IgAN在內的多種腎小球疾病治療。

本研究最終共篩選出19 個火把花根潛在活性成分，預測到285 個藥物靶點及937 個IgAN 疾病靶點，共獲得54 個火把花根干預IgAN 潛在靶點。通過成分-靶點網絡圖的構建與分析，初步預測“雷公藤內酯甲”、“雷公藤春堿”、“雷公藤內酯乙”、“雷公藤紅素”等為火把花根干預IgAN 的核心成分；CDK2、AKR1B1、F2 等為核心靶點；Proteoglycans in cancer信號通路、Lipid and atherosclerosis 信號通路、FoxO 信號通路等為主要富集通路。

3.1 潛在有效成分分析

IgAN 患者機體IgA-IC 形成后沉積于腎小球系膜區，刺激系膜細胞表型轉化為炎癥細胞和纖維化細胞，引起炎癥介質的釋放，造成腎小球損傷及間質纖維化。研究發現NLRP3 炎癥小體的激活及IL-1、IL-18炎癥因子的釋放與IgAN 發病密切相關[32]。雷公藤紅素能夠抑制活性氧生成、促使NF- B 活化上調，進而抑制NLRP3 的表達和IL-1 、IL-18 的釋放發揮抗炎作用[33]。初始CD4+T 細胞分化形成輔助性T 細胞17（Th17）和調節性T 細胞（Treg），二者發揮相反的作用協同維持機體免疫穩態[34]。IgAN 患者體內Th17/Treg穩態破壞，機體Treg水平降低、Th17 比例及Th17/Treg水平升高[35]。研究顯示雷公藤紅素可以抑制Th17 細胞水平、促使Treg細胞生成進而發揮免疫抑制作用[36]。

通過網絡分析初步篩選的活性成分尚有“雷公藤內酯甲”、“雷公藤內酯乙”和“雷公藤春堿”等。研究顯示[37]雷公藤內酯甲對角叉菜膠致炎模型抗炎作用明顯；細胞試驗表明雷公藤內酯甲可以直接抑制T、B 淋巴細胞增殖、發揮免疫抑制作用[38]。雷公藤春堿亦具有強烈的免疫抑制活性，WU 等[39]研究顯示其能明顯抑制脂多糖刺激的小鼠單核巨噬細胞增殖。雷公藤內酯乙的藥理作用研究較少，文獻報道，雷公藤內酯乙能夠阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用[40]。但目前尚缺乏以上成分作用于IgAN 的機制研究，未來可將其作為火把花根干預IgAN 的潛在方向深入研究。

3.2 潛在靶點分析

細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）作為周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的一種，廣泛表達于真核生物中，通過與周期蛋白（Cyclin）結合共同參與細胞周期的調控。系膜細胞增殖與基質增多是IgAN 最基本的病變。既往研究表明腎小球系膜細胞的增殖由多種正負性細胞周期調節蛋白控制，CyclinA-CDK2 的表達和活性增強可以促使系膜細胞增殖[41]；大鼠試驗顯示雷帕霉素可以通過抑制CyclinE-CDK2 的活性，阻斷細胞周期、抑制系膜增殖及基質分泌[42]。

AKR1B1 是糖代謝多元醇途徑的關鍵限速酶，與糖尿病腎病的發生密切相關[43]。當機體處于高血糖狀態時，AKR1B1 活性增強，激活多元醇途徑，葡萄糖還原生成山梨糖醇積聚于細胞內，引起細胞滲透性損傷；同時該通路激活后機體產生大量自由基、晚期糖基化終末產物，抗氧化劑水平下降，引起腎組織氧化應激損傷[44]，而氧化應激是IgAN 進展的主要危險因素之一[45]。此外，糖代謝異常在IgAN 患者中十分常見[46]，多數糖尿病患者的腎臟損傷可表現為IgAN[47]，但AKR1B1 在IgAN 發病中的具體機制有待進一步明確。

研究表明IgAN患者存在凝血、纖溶系統的異常[48]，血液呈高凝狀態[49]。腎小球毛細血管壁與循環中IgA1接觸，造成血管壁受損、引起凝血級聯反應[50]，凝血反應進一步造成腎間質纖維化[51]、腎小球硬化[52]。凝血酶原（F2）是凝血級聯反應的重要節點，被凝血活酶激活生成凝血酶，活化的凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白、刺激血小板聚集和催化一系列凝血相關反應。臨床研究[53]顯示促纖溶治療對IgAN 患者有著獨立于激素之外的腎臟保護作用。

3.3 KEGG富集信息分析

KEGG 分析顯示，交集靶基因富集最明顯的通路是Proteoglycans in cancer 信號通路、Lipid and atherosclerosis 信號通路、FoxO 信號通路。Proteoglycans in cancer 通路中的飾膠蛋白聚糖可以抑制TGF- 1 的表達。而TGF- /Smads 信號通路與IgAN 系膜細胞的增殖及腎小球纖維化的發生密切相關。體外試驗證實IgA1 及血漿凝溶膠蛋白可以刺激系膜細胞中TGF- 1的分泌及下游Smad3、磷酸化Smad2/3、Smad4 的表達，激活TGF- /Smads 信號通路、誘導IgAN 腎纖維化的發生[54]。

多項研究提示IgAN 患者存在血脂異常的臨床表現，患者甘油三酯、總膽固醇顯著上升[55]，且合并血脂異常的患者腎臟病理及腎功能損害更為嚴重[56]。靶向Lipid and atherosclerosis 通路的基因可能通過PI3K/AKT 及VEGF 信號通路影響eNOS 的表達及NO 的釋放、參與細胞凋亡生物過程。研究顯示[57]IgAN 的發生與腎小球系膜細胞增殖過度或凋亡不足密切相關。由此推測火把花根可能通過eNOS/NO 通路影響腎小球細胞凋亡發揮腎臟保護作用。

叉頭框轉錄蛋白O（FoxO）是轉錄因子叉頭框蛋白（FOX proteins）家族的亞家族，廣泛參與細胞代謝、氧化應激、免疫調節和細胞凋亡等生物進程。其中FoxO1 廣泛表達于多種細胞中，研究表明其在足細胞凋亡、腎纖維化中扮演重要角色。劉昆等[58]通過細胞實驗發現在同型半胱氨酸誘導足細胞凋亡中，FoxO1蛋白表達水平下降，提示FoxO1 在保護足細胞凋亡發揮重要作用；此外，FoxO1 可以通過參與PI3K/Akt、Wnt/ -Catenin 等多條信號通路，調控細胞凋亡、氧化應激、炎癥反應等生物過程，抑制腎纖維化的發生[59]。

綜上，火把花根通過多成分、多靶點、多途徑發揮抗炎、免疫抑制等作用，通過抑制系膜細胞增生、腎小球硬化、間質纖維化等病理進程干預IgAN 的發生。本研究基于現有數據庫及網絡藥理學對火把花根干預IgAN 的分子機制進行了預測，預測結果為進一步動物、細胞基礎研究提供了新方向。