羌藥五轉七質量標準研究

沙夢香 李聰穎 張藝 張靜

【摘要】目的：針對羌藥五轉七現行標準缺乏問題，對五轉七藥材進行質量標準研究。方法：對五轉七藥材進行性狀、顯微及薄層色譜（TLC）定性鑒別；按《中華人民共和國藥典（2020年版）》（四部）通則方法檢查藥材中的水分、總灰分、酸不溶性灰分，測定醇溶性浸出物的含量；采用HPLC法，以獐牙菜苷、馬錢苷酸、綠原酸為指標，建立多成分含量測定方法。結果：10批五轉七藥材有相似的性狀及顯微特征；薄層色譜斑點清晰，分離度好；10批五轉七藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量分別為6.71%～9.36%、2.59%～6.56%、0.64%～2.59%、8.37%～13.55%；獐牙菜苷、馬錢苷酸、綠原酸線性關系范圍分別在101.05～606.3 μg·mL-1、26.9～323.7 μg·mL-1、5.06～101.2 μg·mL-1 （r=0.9995、r=1.0000、r=0.9999）線性關系良好，儀器精密度、重復性、穩定性、加樣回收率的RSD值均符合要求；3種成分含量分別為0.0172%～0.0611%、0.0043%～0.0405%、0.0956%～0.2234%。結論：基于研究結果，初步擬定羌藥五轉七中水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、7.0%、3.0%，醇溶性浸出物不得低于8.0%，獐牙菜苷的含量不得低于0.10%。

【關鍵詞】羌藥五轉七；質量標準；顯微鑒別；TLC；HPLC；含量測定

【中圖分類號】R284.1【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）10-0028-06

Study on? Quality Standard of Qiang Medicine WuzhuanqiSHA Mengxiang1，2LI Congying1，2ZHANG Yi1，2*ZHANG Jing1，2

1.School of Ethnic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；

2.Academic Inheritance and Innovation Research Center of Ethnic Medicine，Chengdu University

of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，ChinaAbstract：Objective Aiming at the lack of the current standard of Qiang medicine “Wuzhuanqi”， study on the quality standard of Wuzhuanqi.Method To identify the characters， microscopic and TLC of Wuzhuanqi medicinal materials; According to the general principles of Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （2020 Edition） （Part IV）， check the water， total ash and acid-insoluble ash in medicinal materials， and determine the content of alcohol-soluble extract; HPLC method was used to establish a multi-component content determination method with swertiamarin， loganin and chlorogenic acid as indicators.Result Ten batches of Wuzhuanqi medicinal materials have similar characters and microscopic characteristics; Thin-layer chromatographic spots are clear and the resolution is good; The contents of water， total ash， acid-insoluble ash and alcohol-soluble extract in 10 batches of Wuzhuanqi were 6.71%-9.36%，2.59%-6.56%， 0.64%-2.59% and 8.37%-13.55% respectively.The linear relationships of swertiamarin， loganic acid and chlorogenic acid were 101.05-606.3 μg·mL-1， 26.9-323.7 μg·mL-1 and 5.06-101.2 μg·mL-1（r=0.9995，r=1.0000，r=0.9999），respectively.The contents of three components are 0.0172%-0.0611%， 0.0043%-0.0405%， 0.0956%-0.2234% respectively.Conclusion Based on the results of this study， it is preliminarily determined that the water content， total ash content and acid-insoluble ash content of Qiang medicine Wuzhuanqi should not exceed 10.0%， 7.0% and 3.0% respectively， the alcohol-soluble extract should not be lower than 8.0%， and the content of Swertiamarin should not be lower than 0.10%.

Keywords：Qiang Medicine Wuzhuanqi; Quality Standards; Microscopic Identification; TLC; HPLC; Content Determination

五轉七是羌族地區常用的民族藥，羌語為“mo te be”，音譯為“莫喆·補惹”，也稱“吾落哈”，為忍冬科植物穿心莛子藨Triosteum himalayanum Wall.的干燥全草。夏、秋二季采挖，除去雜質，洗凈，曬干用［1］。性寒，味苦，具有利尿消腫、理氣活血、調經的功效，主治小便不通、浮腫、月經不調、勞傷疼痛等［2］。在羌醫藥臨床應用中，五轉七與其他草藥配伍常用于治療“筋骨疼痛，跌打損傷”。五轉七始載于《陜西中草藥》（異名：包谷花、鉆子七、包谷陀子、達對月草）［3］，在《羌族醫藥》［1］《中國民族藥辭典》［2］《中國植物志》［4］《中華本草》［5］《全國中草藥匯編》［6］中均有記載。

目前未有相關標準收載五轉七，缺乏質量控制；文獻研究方面只對其化學成分進行了研究，環烯醚萜類、黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類、糖類等化學成分為其主要活性成分［7-8］。基于此，在“四川省藥品監督管理局中藥（民族藥）標準提升”項目中增加了五轉七質量標準，以期對該藥材的質量進行全面控制。

1儀器與材料

1.1儀器 島津2030型高效液相色譜儀、DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、FA1004型萬分之一分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、BSA124S型十萬分之一分析電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］、SB-8200DTS型雙頻超聲儀（寧波新藝超聲設備有限公司，功率 400 W，頻率 40 kHz）、UPH-I型超純水機（四川優普超純科技有限公司）。

1.2藥品與試劑 五轉七藥材采自四川甘孜州、阿壩州等地，經成都中醫藥大學民族醫藥學院張藝研究員鑒定為忍冬科植物穿心莛子藨Triosteum himalayanum Wall.的干燥全草，其信息來源詳見表1。馬錢苷酸對照品（批號PS010047，純度≥98.5%）、綠原酸對照品（批號PS010694，純度≥98.5%）、獐牙菜苷對照品（批號PS010483，純度≥99%），均購自成都普思生物科技股份有限公司，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2方法與結果

2.1性狀鑒別 本品根狀莖呈不規則團塊狀，表面棕褐色，密生莖痕及疣狀突起。主根不明顯，側根較多，密生須根，表面棕褐色，外表皮易脫落，皮層呈淺黃棕色，不易折斷。莖表面紅棕色，被毛，易折斷，斷面中空。葉多皺縮，灰綠色，上表面被白色長剛毛，下表面脈上毛較密。偶見核果，卵形，表面黑棕色或黃棕色，被毛。如圖1、圖2所示。

2.2顯微鑒別 本品粉末為棕褐色。淀粉粒團多；導管常見，螺紋導管和孔紋導管交互存在；非腺毛較多，單細胞，多碎斷，呈柱形；草酸鈣簇晶常見，獨立存在或聚集在一起。如圖3所示。1.非腺毛;2.導管;3.草酸鈣簇晶;4.淀粉粒團

2.3TLC鑒別 取10批五轉七藥材粉末1 g，加入甲醇25 mL，超聲（功率400 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，濾過，濾液干，用3 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取對照品熊果酸適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502），吸取上述供試品溶液3 μL和對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-甲烷-冰醋酸（20∶8∶5∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點或熒光斑點。如圖4所示。

2.4檢查 考慮到藥材來源的差異，本研究水分、總灰分和酸不溶性灰分以略高于最高測定值設限，醇溶性浸出物、含量測定以略低于最低測定值設限［10］。

2.4.1水分 取10批五轉七藥材粉末適量，精密稱定，按2020年版《中國藥典》［9］（四部）“通則0832水分測定法”項下 “烘干法”進行測定，每批平行3次，取平均值。結果，10批五轉七藥材的水分含量為6.71%～9.36%，初步擬定限度不得過10.0%。五轉七藥材中水分測定結果見表2。

2.4.2總灰分和酸不溶性灰分 取10批五轉七藥材粉末適量，精密稱定，按2020年版《中國藥典》［9］（四部）“通則2302灰分測定法”項下總灰分和酸不溶性灰分測定法進行測定，每批平行3次，取平均值。結果，10批五轉七藥材的總灰分含量為2.59%～6.56%，規定限度不得過7.0%；酸不溶性灰分含量為0.64%～2.59%，初步擬定限度不得過3.0%。五轉七藥材中總灰分和酸不溶性灰分測定結果見表2。

2.4.3醇溶性浸出物測定 取10批五轉七藥材粉末各約2 g，按2020年版《中國藥典》［9］（四部）“通則2201浸出物測定法”項下醇溶性浸出物測定法（熱浸法）進行測定，溶劑為50%乙醇，每批平行3次，取平均值。結果，10批五轉七藥材醇溶性浸出物的含量為8.37%～13.55%，根據測定結果，初步擬定限度不得少于8.0%。五轉七藥材中醇溶性浸出物測定結果見表2。

2.5馬錢苷酸、綠原酸和獐牙菜苷含量測定

2.5.1混合對照品溶液的制備 取馬錢苷酸、綠原酸、獐牙菜苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加甲醇定容，制成上述3個成分質量濃度分別為0.678 mg·mL-1、0.630 mg·mL-1、1.176 mg·mL-1的混合對照品貯備液。置4 ℃冰箱中保存，備用。

2.5.2供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5.3色譜條件 色譜柱：賽默飛Hypersilgold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）—0.4%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～22 min，8%A→8%A；22～23 min，8%A→10%A； 23～35 min，10%A→10%A）。檢測波長：240 nm；流速：1.0 mL.min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按獐牙菜苷計應大于3000，HPLC圖如圖5所示。A.對照品;B.樣品;C.空白溶劑;1.馬錢苷酸;2.綠原酸;3.獐牙菜苷

2.5.4線性關系及定量限、檢測線考察 將“2.5.1”項下混合對照品儲備液按不同的倍數稀釋。稀釋液分別按色譜條件進樣10 μL，測定并計算平均峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標（X），以色譜峰面積為縱坐標（Y）進行線性關系考察。結果，各待測成分線性關系均良好（r>0.9995）。配制一個較低濃度的對照品溶液，注入液相色譜儀進行測定，記錄峰面積，分別以信噪比3∶1、10∶1測定檢測限、定量限。結果見表3。

2.5.5精密度試驗 取同一對照品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件于同一天內連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，馬錢苷酸，綠原酸，獐牙菜苷峰面積的RSD分別為0.95%、0.86%、0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.6重復性試驗 取同一批次五轉七藥材粉末共6份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入標準曲線計算樣品中各成分含量。結果顯示，馬錢苷酸，綠原酸，獐牙菜苷含量的RSD分別為0.74%、0.49%、0.83%（n=6），表明方法重復性良好。

2.5.7穩定性試驗 取五轉七藥材粉末（過四號篩）0.5 g，精密稱定，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0 h、6 h、12 h、18 h、20 h、24 h時，按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，馬錢苷酸、綠原酸、獐牙菜苷峰面積的RSD分別為0.74%、0.87%、0.68%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.8加樣回收率試驗 取已知含量的同一批五轉七樣品6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入藥材中獐牙菜苷含量的約50%的對照品溶液，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結果顯示，馬錢苷酸、綠原酸、獐牙菜苷的平均加樣回收率分別為106.32%、96.70%、98.54%，RSD分別為1.21%、0.58%、1.62%（n=6），表明本方法準確度良好。結果見表4。

2.5.9樣品含量測定 分別取10批五轉七藥材粉末適量，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并根據標準曲線計算各成分的含量。結果10批五轉七樣品中，馬錢苷酸、綠原酸、獐牙菜苷的含量分別為0.0172%～0.0611%、0.0043%～0.0405%、0.0956%～0.2234%。結果見表5。

3討論

3.1TLC鑒別與含量測定指標成分的選擇 文獻［11］報道，穿心莛子藨主要化學成分為環烯醚萜類、黃酮類等，熊果酸具有清熱、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗潰瘍、降低血糖、抗氧化等多種生物學效應［11］，獐牙菜苷為環烯醚萜類成分，其具有保護骨關節、鎮痛、抗炎、保肝等藥理活性作用［12］；馬錢苷酸具有抗炎等藥理作用［13］；綠原酸具有抗菌、抗炎、抗誘變等藥理作用［14］，與五轉七“利尿消腫，理氣活血”的主要功效相關。研究前也嘗試過鑒別及測定其他成分，但結果不理想，最終確定選用熊果酸作為五轉七藥材TLC鑒別的指標成分，選擇獐牙菜苷作為該藥材含量測定的指標成分。

3.2TLC條件篩 選本研究前期對不同的濕度（32 ％RH和88 ％RH）以及溫度（4 ℃和35 ℃）的耐用性進行了考察，結果表明，不同溫度下Rf值會隨溫度的升高而有所增大，濕度對薄層色譜斑點無明顯影響。此外還對不同展開系統［二氯甲烷—甲醇—冰醋酸（10∶1.6∶0.1）、環己烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶6∶1）、環己烷—二氯甲烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）］、不同顯色條件和觀察方法［5%香草醛硫酸、10%硫酸乙醇（日光、紫外光燈（365 nm）、3%三氯化鋁（日光、紫外光燈（365 nm）］進行了考察，結果顯示，以環己烷—二氯甲烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）為展開劑，以10%硫酸乙醇為顯色劑，在紫外光燈（365 nm）條件下，供試品與對照品色譜在相應位置上顯示相同顏色的斑點，且斑點清晰，Rf值適中，無拖尾，故以此為展開條件。

3.3HPLC供試品溶液制備方法考察 本研究前期對不同的提取溶媒（95%、70%、50%、30%乙醇，70%、50%、30%甲醇）、不同提取方式（超聲、回流）、不同溶媒用量（25 mL、50 mL、100 mL）、不同提取時間（15 min、30 min、60 min）等因素進行了考察，結果表明，以甲醇為提取溶媒時，獐牙菜苷、馬錢苷酸、綠原酸干擾峰少且峰形較好，故選擇甲醇作為提取溶媒；兩種提取方法均能較好地提取出有效成分，考慮到操作簡便易行，選擇超聲作為提取方法；溶媒用量為25 mL，提取30 min時，獐牙菜苷、馬錢苷酸、綠原酸提取效率較高。

3.4HPLC色譜條件的選擇 本研究通過對馬錢苷酸、綠原酸、獐牙菜苷3種成分在190～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，得到3種成分的最大吸收波長依次為236 nm、327 nm、246 nm，經過各波長色譜峰比較，在240 nm波長時色譜圖峰形最好，分離度均大于1.5且基線平穩，由此選擇240 nm為檢測波長。此外，本研究也對不同流動相（甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）、不同流速（0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.2 mL·min-1、不同色譜柱（Chromsil C18、 HypersilgoldC18、 Zorbax Eclipse XDB-C18）等進行了考察，結果表明，以甲醇-0.4%磷酸水溶液為流動相時獐牙菜苷、馬錢苷酸、綠原酸有較好的分離度，該方法系統耐用性良好。

3.5含量測定結果分析 根據實驗結果，五轉七藥材中獐牙菜苷含量最高（獐牙菜苷、馬錢苷酸、綠原酸的平均含量分別為13.51 mg·g-1、4.00 mg·g-1、1.87 mg·g-1），占測定的3種成分總含量的64.60%。綜合考慮獐牙菜苷成分的藥理活性作用及五轉七藥材的功效，選擇獐牙菜苷作為該藥材的含量限定指標成分。

4結論

根據2020年版《中國藥典》［9］（四部）通則中關于中藥材質量控制的要求，本研究對五轉七藥材的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分、酸不溶性灰分和浸出物、含量測定進行系統研究，為羌藥五轉七藥材質量標準的制訂提供了科學依據。

綜上所述，根據研究結果，初步擬定了羌藥五轉七中水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、7.0%、3.0%，醇溶性浸出物不得低于8.0%，獐牙菜苷的含量不得低于0.10%。所建方法準確可靠、重復性好，為五轉七藥材質量標準的制定奠定了基礎。本研究不足之處在于樣品批次較少，后續將繼續采集其他不同產地的樣品進行研究，以建立更加完善的藥材質量標準。

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（收稿日期：2022-09-02編輯：陶希睿）