單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP檢測方法的建立及應(yīng)用

陳平亞 何翠華 張亮亮 吳少榮 王綏家 趙光遠(yuǎn)

摘要 ［目的］建立一種單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）檢測方法，并對其檢測敏感性、特異性進(jìn)行評價。［方法］針對單增李斯特菌的actA基因序列，設(shè)計6條LAMP特異性引物，通過對LAMP反應(yīng)體系中的反應(yīng)溫度、內(nèi)外引物濃度比、鎂離子濃度等各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)反應(yīng)體系。以單增李斯特菌株CMCC54006株為陽性對照，其他菌株為陰性對照，驗證LAMP檢測方法的特異性。將純培養(yǎng)的單增李斯特菌菌液提取DNA后10倍梯度稀釋為模板進(jìn)行LAMP檢測，以測定該檢測方法靈敏度。［結(jié)果］建立了特異性檢測單增李斯特菌的LAMP檢測方法，優(yōu)化后確定了檢測體系中FIP/BIP與F3/B3 的終濃度比為1.6∶0.2，鎂離子濃度為6 mmol/L，dNTPs濃度為1.6 mmol/L，反應(yīng)溫度為65 ℃。特異性檢測結(jié)果顯示，僅單增李斯特菌反應(yīng)管中的反應(yīng)液呈綠色，表明建立的檢測方法具有較高特異性。以單增李斯特菌DNA為模板進(jìn)行的LAMP檢測結(jié)果顯示，LAMP檢測方法靈敏度為64 copies/mL。［結(jié)論］建立單增李斯特菌的LAMP檢測方法，高效特異，靈敏度高，可直接觀察檢測結(jié)果，適合現(xiàn)場檢測。

關(guān)鍵詞 單增李斯特菌；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；actA基因

中圖分類號 TS207.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）10-0074-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.016

Abstract ［Objective］ The objective of this study is to establish a rapid and specific method to detect? Listeria monocytogenes using loopmediated? isothermal amplification.［Method］ Six specific LAMP primers were designed to target the actA gene of L.monocytogenes.Singlefactor experiments were conducted to optimize the parameters of the reaction system .The specificity of LAMP was tested by using? non L.monocytogenes.The sensitivities of? LAMP were compared by using tenfold serially diluted DNA as templates.Furthermore，the samples? which may be infected by L.monocytogenes were detected by LAMP method.［Result］The LAMP assay for rapidly and specifically detecting L.monocytogenes was established.The reacting temperature was determined as 65 ℃ ，the concentration of Mg2+ was 6 mmol/L? and? the concentration of dNTPs was 1.6 mmol/L.The concentration ratio of inner and outer primers was 1.6∶0.2.The result of specificity test showed that only the reaction liquids with the DNA of? L.monocytogenes? change green.Sensitivity experiments indicated that the detection limit could reach 64 copies/mL.［Conclusion］ The LAMP assay had advantages of sensitivity and specificity，the reaction results could be directly observed by naked eyes and? suitable to be widely used in grassroots units.

Key words Listeria monocytogenes;LAMP;actA gene

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，單增李斯特菌）是一種常見的兼性厭氧的革蘭陽性食源性致病菌，能在土壤、地表水及冰箱中生存，能通過糞口傳播［1］。單增李斯特菌能夠穿越動物血腦屏障、血胎屏障［2］，引起敗血癥、腦膜炎等，為避免食品安全事件，需要建立快速、靈敏、特異性的單增李斯特菌檢測方法。

目前，單增李斯特菌的國標(biāo)鑒定方法是平板分離培養(yǎng)，樣品中單增李斯特菌的檢測經(jīng)過2次增菌、選擇性培養(yǎng)基分離以及生化鑒定，全過程耗時長。目前分子生物學(xué)檢測方法被廣泛應(yīng)用，如熒光定量PCR技術(shù)、重組酶聚合酶擴增技術(shù)、CRISPR 技術(shù)等［3］。LAMP技術(shù)是在Bst酶的作用下，在恒溫條件下反應(yīng)45 min即可完成核酸擴增，擴增結(jié)果可通過染料顏色、濁度等判斷反應(yīng)結(jié)果，耗時少且對試驗儀器的要求低［4］。該研究以單增李斯特菌的保守基因actA作為靶基因來建立LAMP的檢測方法，用于單增李斯特菌的現(xiàn)場快速檢測。

LAMP可以在恒溫條件下特異、快速地擴增核酸，不需要昂貴的溫控設(shè)備、檢測成本低且結(jié)果可視，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等病原體的快速檢測［5］。針對特異性目標(biāo)基因中6個區(qū)域設(shè)計6條引物，利用Bst DNA聚合酶擴增。在DNA合成過程中，從脫氧核糖核酸三磷酸（dNTPs）底物中析出的焦磷酸離子與體系中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀，其難溶于水，且可通過肉眼直接觀察［6］，因此可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標(biāo)，也可向PCR管中添加染料輔助觀察擴增結(jié)果，該試驗通過加入0.2 μL SYBR Green I （10×）染料，加入反應(yīng)管蓋中37 ℃烘干4 h，待 LAMP 反應(yīng)結(jié)束后，顯色染料與反應(yīng)液混勻，根據(jù)顯色結(jié)果對樣本的陰陽性進(jìn)行判斷。

對單增李斯特菌CMCC54006菌株actA基因序列（DQ309883.2）進(jìn)行測序，將actA基因與其他菌株的同源序列進(jìn)行比對分析后，利用Primer ExplorerV5 軟件在線設(shè)計LAMP引物。筆者以actA毒力基因為單增李斯特菌靶基因建立熒光LAMP檢測方法，建立快速精準(zhǔn)檢測單增李斯特菌的技術(shù)，有助于及時檢測單增李斯特菌，以確保食品安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試標(biāo)準(zhǔn)菌株包括單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、大腸埃希氏菌（Escherichia colt）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。

試驗主要試劑：培養(yǎng)基購自北京陸橋公司; MgSO4、SYBR Green I 染料購自Sigma公司; dNTP、Bst DNA聚合酶購自上海研拓生物科技有限公司; DNA marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自上海生工生物技術(shù)有限公司; 6 × DNA LoadingBuffer購自天根生物技術(shù)公司; 瓊脂糖購自西班牙Biowest公司。

試驗主要儀器：DYY-10C型電泳儀，購自北京市六一儀器廠;凝膠成像，儀購自美國UVP公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 LAMP特異性引物、探針設(shè)計。LAMP特異性引物的設(shè)計根據(jù)單增李斯特菌的actA基因，利用LAMP在線引物設(shè)計軟件 Primer Explorer V5設(shè)計特異性引物。F3：CGAAAGCGCCTCAGTTTA；B3：CGTGGGTGTACATGTAATCG；FIP：GTCTCGAACAAGGCGTGAGTTTCATCAAGGCACAAGCG；BIP：CCGAAGAGCACGGTTTCGTCGATGAGCGGTTGATGTC；LoopF：CGTGATGTTGTAACCTTGCG；LoopB：GCGAGCGATCCTTGTTTG。

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化。

25 μL反應(yīng)體系包括： 外引物F3和B3，內(nèi)引物 FIP和BIP，MgCl2，緩沖溶液（ Buffer）， dNTPs，DNA模板，BstDNA聚合酶。在65 ℃恒溫水浴鍋中恒溫1 h，然后80 ℃滅活5 min終止反應(yīng)。優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系各參數(shù)，包括內(nèi)外引物濃度（μmol/L）比（0.8∶0.2、1.0∶0.2、1.2∶0.2、1.4∶0.2、1.6∶0.2、1.8∶0.2、2.0∶0.2）、鎂離子終濃度（1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L ）、dNTP濃度（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L）、BstDNA聚合酶濃度（0.16、0.20、0.24、0.28、0.32 U/μL）以及反應(yīng)所需的最適溫度，擇優(yōu)建立LAMP反應(yīng)體系。

1.2.3 LAMP反應(yīng)的特異性。以單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）、威氏李斯特菌（Listeria welshimeri）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）等病原體作為對照菌株，并用去離子水作為空白對照，驗證LAMP法檢測單增李斯特菌的特異性。

1.2.4 LAMP反應(yīng)的靈敏度試驗。

采用稀釋平板法計算得到初始菌液濃度為6.4×106 CFU/mL的菌懸液，再用0.9%生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備濃度為6.4～6.4×106 CFU/mL的菌液，分別提取單增李斯特菌DNA，按上述LAMP體系進(jìn)行檢測。以各稀釋濃度的DNA為模板，以ddH2O為空白對照，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。以確定靈敏度。取5 μL LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察試驗結(jié)果。

1.3 模擬樣品LAMP檢測方法的應(yīng)用

以市場購買的新鮮豬肉作為原始模擬樣本，稱取25 g采用國標(biāo)GB 4789.30—2016方法進(jìn)行單增李斯特菌的分離培養(yǎng)鑒定，單增李斯特菌檢測陰性的豬肉樣本被認(rèn)為無單增李斯特菌污染，可用于制備模擬樣本。挑取參考株CMCC54006單菌落接種到5 mL BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min增菌直至OD600達(dá)到0.6，吸取100 μＬ增菌液到900 μL PBS緩沖液中進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，得到6.4×104 CFU/mL的菌液。

在市場中采集362份速凍肉類及肉加工制品，取25 g樣品加入225? mL無菌生理鹽水均質(zhì)，制成肉糜類樣品均質(zhì)液，將濃度為6.4×108 CFU/mL菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備濃度為6.4×104 CFU/mL的菌液，取不同濃度的初始菌液1 mL分別加入9? mL速凍肉糜類樣品均質(zhì)液中，37? ℃培養(yǎng)10 h后，取1? mL菌液提取細(xì)菌基因組 DNA，分別采用該研究建立的LAMP反應(yīng)方法和國標(biāo)GB 4789.30—2016方法進(jìn)行檢測，用PALCAM平板和單增李斯特菌顯色平板劃線培養(yǎng)，再進(jìn)行生化試驗鑒定。比較2種方法的檢測結(jié)果，并計算總體符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測方法反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化。LAMP反應(yīng)設(shè)置61～66 ℃ 6個連續(xù)反應(yīng)溫度，從圖1可見，6個反應(yīng)溫度下均有擴增條帶，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中條帶的清晰度及整齊度，確定最佳反應(yīng)溫度為65 ℃。

2.1.2 鎂離子濃度優(yōu)化。當(dāng)鎂離子濃度在1～8 mmol/L時，Mg2+含量過低或過高都會影響LAMP反應(yīng)，Mg2+濃度為6 mmol/L 時，LAMP反應(yīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中條帶最亮，確定該鎂離子濃度為反應(yīng)體系的最佳濃度（圖2）。

2.1.3 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化。LAMP反應(yīng)中，不同的內(nèi)外引物濃度比為1.8∶0.2、2.0∶0.2時，條帶較暗；當(dāng)內(nèi)外濃度比為0.8∶0.2、1.0∶ 0.2、1.2∶0.2、1.4∶0.2時，對 LAMP反應(yīng)結(jié)果的影響不顯著，內(nèi)外引物比為1.6∶0.2時條帶最亮。因此，選擇其作為該擴增體系的內(nèi)外引物濃度比（圖3）。

2.1.4 dNTPs濃度優(yōu)化。不同的dNTPs添加量對擴增反應(yīng)影響明顯，dNTPs濃度為0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L時，LAMP反應(yīng)條帶較暗，dNTPs濃度為1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L時，條帶較亮且無顯著差異，因此選擇LAMP反應(yīng)的dNTPs濃度為1.6 mmol/L（圖4）。

2.1.5 Bst DNA聚合酶濃度優(yōu)化。不同的Bst DNA聚合酶添加量對擴增反應(yīng)影響明顯，酶濃度為0.32 U/μL時，LAMP反應(yīng)條帶較亮，因此選擇LAMP反應(yīng)的Bst DNA聚合酶濃度為0.32 U/μL（圖5）。

2.2 LAMP檢測方法特異性分析

分別以單增李斯特菌及其他菌株的DNA為模板，按照建立的LAMP方法進(jìn)行擴增反應(yīng)，觀察各反應(yīng)管中顏色，其中單增李斯特菌DNA有條帶，對應(yīng)的反應(yīng)管中呈綠色，其他菌株及空白對照無條帶且反應(yīng)液為橙黃色，表明該試驗設(shè)計的引物具有較強的特異性（圖6）。

2.3 LAMP檢測方法靈敏度分析

將濃度為6.4～6.4×106 copies/μL單增李斯特菌菌液基因組DNA，同時按PCR方法和建立的 LAMP方法進(jìn)行擴增。結(jié)果顯示，LAMP法檢測單增李斯特菌的下限為64 copies/μL（圖7），該研究建立的LAMP方法敏感性較高。

2.4 LAMP檢測方法的應(yīng)用

對362份速凍肉類及加工制品模擬樣本進(jìn)行LAMP方法和國標(biāo)方法GB 4789.30—2016檢測。LAMP方法檢測結(jié)果顯示，除了單增李斯特菌基因組DNA陽性對照外，33份樣品檢測到單增李斯特菌，結(jié)果見表1。與國標(biāo)法檢測結(jié)果符合率為 100%，顯示該 LAMP 方法具有良好的可靠性。

3 討論

該研究基于actA基因序列設(shè)計了檢測單增李斯特菌的LAMP檢測方法擴增引物，以其為靶序列設(shè)計LAMP擴增引物，并驗證其靈敏性和特異性。若擴增結(jié)果通過電泳進(jìn)行判斷，會因氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽性，且電泳判斷結(jié)果費時費力。該試驗中反應(yīng)前于PCR管內(nèi)加入染料，反應(yīng)結(jié)束后無需開蓋即可觀察結(jié)果，避免污染，不需要PCR儀等昂貴儀器，僅用水浴鍋即可檢測，成本低，效率高，適合基層實驗室應(yīng)用，具有較強的應(yīng)用前景。

該研究建立的可視化LAMP方法靈敏度可以達(dá)到64 copies/μL。賀生芳等［7］針對單增李斯特菌iap基因設(shè)計LAMP引物和探針，建立了最低檢測限為2.21 CFU/mL 的檢測體系。賈甜甜［8］針對單增李斯特菌hly基因建立最低檢測限為94.70 CFU/mL的LAMP檢測體系。姜霞等［9］針對編碼溶血素的hly基因設(shè)計引物和探針，對單增李斯特菌純菌液的檢測靈敏度為88.00 CFU/mL，人工污染肉中單增李斯特菌的檢測靈敏度為880.00 CFU/mL。顧思宇等［10］針對Lm編碼內(nèi)化素蛋白基因建立了檢測下限為38 CFU/mL的LAMP檢測方法，但該方法未做到可視化檢測。在不同的LAMP反應(yīng)體系中，靈敏度有少許差異，原因可能是在不同引物長度、引物溶解溫度、引物間距離、GC含量、引物末端穩(wěn)定性與二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致引物和模板的結(jié)合率受到了不同程度的影響，也可能與反應(yīng)中酶活性、化學(xué)試劑及操作有關(guān)［11］。

利用該可視化LAMP方法對單增李斯特菌和其他食源性致病菌進(jìn)行檢測，只有單增李斯特菌出現(xiàn)陽性反應(yīng)，證實該可視化LAMP方法具有很好的特異性。當(dāng)LAMP擴增進(jìn)行時，白色焦磷酸鎂沉淀與反應(yīng)液中的雙鏈DNA含量成正比，因此可通過濁度儀檢測焦磷酸鎂的沉淀量來判定是否發(fā)生擴增反應(yīng)［12］。也可在反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素，其能在Mg2+ 離子與焦磷酸根離子結(jié)合時發(fā)出熒光［5］。該試驗通過在LAMP反應(yīng)體系中添加SYBR Green I染料，建立可視化LAMP反應(yīng)，減小開蓋時造成的氣溶膠擴散，避免檢測結(jié)果假陽性。

4 結(jié)論

該研究根據(jù)單增李斯特菌 actA基因序列設(shè)計特異性引物，建立了可視化LAMP檢測方法。該檢測方法靈敏度高，最低檢測限為64 copies/μL；特異性強，與金黃色葡萄球菌等其他食源性致病菌無交叉反應(yīng)。LAMP檢測時間短只需要45 min，現(xiàn)場操作步驟簡單，只需一臺金屬浴，檢測試劑成本較低。對樣品的檢測結(jié)果與國標(biāo)方法檢測結(jié)果一致，可在食品安全檢測中應(yīng)用于對單增李斯特菌的快速檢測。

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