茄子葉際固氮菌的分離鑒定·培養特性及抑菌活性

幸翀 郭青云

摘要 采用Ashby無氮培養基從茄子葉際分離得到1株具有高效固氮性能的自生固氮菌QZ-1，經16S rDNA序列鑒定，該菌株與克雷伯氏菌屬各菌株同源性高達99%以上，初步鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.），其在酵母粉為碳源、pH為5.0時生長最好。菌株QZ-1具有廣譜抗真菌活性，對油菜菌核病、葡萄炭疽病、番茄灰霉病抑制效果可達40%以上。自生固氮菌QZ-1具有固氮和生防作用，可為進一步研發優良的葉際固氮菌肥提供微生物資源。

關鍵詞 茄子；葉際固氮菌；克雷伯氏菌；分離鑒定；培養特性；抑菌活性

中圖分類號 S182? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）10-0001-04

Abstract A nitrogenfixing bacteria strain QZ1 in the phyllosphere of Solanum melongena L.was screened using Ashby nitrogenfree medium.By 16S rDNA sequence analysis，the homology between strain QZ1 and Klebsiella isolated was up to 99%，thus，the isolated strain was identified as Klebsiella sp..The growth of strain QZ1 was better with yeast powder as carbon source at pH 5.0.Strain QZ1 had broadspectrum antifungal activity，with an inhibitory effect of over 40% on Sclerotinia sclerotiorum，grape anthracnose and Botrytis cinerea.The autotrophic nitrogen fixing bacterium QZ1 had nitrogen fixation and biocontrol effects，which could provide microbial resources for the further development of nitrogenfixing bacteria fertilizer.

Key words Solanum melongena L.;Nitrogenfixing bacteria from phyllosphere;Klebsiella sp.;Isolation and identification;Cultural characteristic;Antifungal activity

植物葉際存在許多有益的微生物種群，在一定程度上促進植物生長、拮抗植物病原菌。固氮菌可以定殖在植物葉際，通過固定空氣中的氮氣為植物生長提供必需營養物質，促進植物生長繁殖，在自然生態系統氮循環中發揮著重要的作用［1-2］。固氮菌是植物葉際的主要微生物類群，大多為細菌，目前已分離出的葉際固氮菌主要包括固氮菌屬（Azotobacter）、氣桿菌屬（Aerobaeter）、拜氏固氮菌屬（Beijerinekia）、黃桿菌屬（Flavobaeterium）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、分枝桿菌屬（Myeobaeterium）、克氏桿菌屬（Klebsiella）、螺菌屬（Spirillum）等［2-4］。研究發現葉際固氮菌不僅具有較高的固氮能力，還能促進作物生長，提高作物產量。如將森林植物葉際分離出Flavobacterium sp.TK2，接種于玉米葉際，可使產量提高約1/3［5］。水稻葉際固氮菌具有溶磷作用并能產生吲哚乙酸，可促進水稻生長［6］。葉際固氮菌還能產生抗菌物質，降低玉米大、小斑病的發病率，提高植物抗病能力，間接促進作物生長發育［3-4］。因此，固氮菌被廣泛用于生物菌肥中，在取代氮肥的施用上具有廣闊前景。

茄子（Solanum melongena L.）是我國廣泛種植的蔬菜作物，營養豐富，食用方法多樣，深受人民喜愛。茄子生長周期長，需要大量的營養物質，氮素是限制茄子生長的主要營養元素［7］。合理施用氮肥可以使茄子增產增收，但多年連續施用氮肥，不僅會增加農業種植成本，還會污染環境，造成土壤板結、肥力下降，甚至威脅人體健康。生物固氮具有成本低、高效、無污染等優點被廣泛用于生物菌肥中，大多數農作物施用葉際固氮菌劑后，可以促進養分的吸收，減少氮肥和農藥的用量，提高作物的產量和品質［7-8］。茄子葉際存在大量固氮微生物，與茄子生長發育密切相關，該研究利用傳統微生物學方法分離篩選茄子葉際固氮菌，并對其培養特性和抗菌活性進行研究，可為生物菌肥生產提供固氮菌種資源，對農業的生產發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茄子樣品于2021年9月采自農民自種蔬菜園，取樣時每個樣品隨機選取5株植物，戴上無菌手套進行采集，選取地上葉片，所取葉片位于新葉與老葉之間，避免沾染泥土引起試驗誤差，將采集到的葉片混合放入無菌培養皿中，24 h內對葉片進行處理。

1.2 供試病原菌

棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum Lib.）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、葡萄炭疽病菌（Colletot-richum gloeosporioides）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）均由贛南師范大學生命科學學院袁小勇教授提供。

1.3 茄子葉際固氮菌分離篩選

將取回的新鮮葉片置于裝有100 mL無菌磷酸緩沖液（pH 7.0，含0.1% Tween）的錐形瓶中，保證溶液完全浸沒葉片，25 ℃ 200 r/min搖床振蕩30 min，超聲波40 kHz 超聲5 min，用鑷子取出葉片，將其余的溶液轉移至50 mL離心管中，然后以10 000 r/min離心10 min，倒掉上清，收集得到沉淀菌體。吸取 100 μL稀釋液平板涂布法均勻接種到固體Ashby無氮培養基上，28 ℃培養5 d。根據菌落形態選擇長勢較好、生長速度較快的不同菌落進行劃線純化，直至出現有規則的單菌落。

1.4 菌株16S rDNA和nifH基因的PCR擴增

將篩選獲得的固氮菌接種于LB液體培養基中，于28 ℃、200 r/min的搖床中過夜培養，收集菌體，用天根細菌基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取，以細菌16S rDNA全序列通用引物27F/1492R［9］和固氮基因nifH特定的引物PolF/PolR［10］分別進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。擴增的PCR產物送至北京擎科生物有限公司測序，使用NCBI數據庫進行序列比對，利用MEGA 7.0軟件采用最大似然（ML）算法構建系統發育樹。

1.5 固氮酶活性測定

按照微生物固氮酶（NITS）ELISA試劑盒說明書操作測定。取96孔酶標板，分別依次加入待測樣本10 μL，樣本稀釋液40 μL，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL，37 ℃溫育60 min，棄去液體，然后加入200 μL洗滌緩沖液洗板5次，加入顯色液37 ℃避光孵育15 min，加入終止液50 μL終止反應于15 min內在450 nm波長處測定OD值。同時以不同標準活性的標準品為對照繪制標準曲線，依據標準曲線計算樣本固氮酶活性。每個樣本至少重復3次。

1.6 菌株培養特性研究

1.6.1 pH對菌株生長的影響。

取等量的細菌培養液接種于pH為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的LB液體培養基中，每個pH至少做3個平行試驗，置于28? ℃下180 r/min恒溫振蕩培養箱中培養48 h，測定菌液OD600的平均值，確定菌株的最適生長pH。

1.6.2 NaCl濃度對菌株生長的影響。

取等量細菌培養液接種到含NaCl質量分數為0、1%、2%、3%和4%的LB液體培養基中，至少做3個平行試驗，置于28? ℃下180 r/min恒溫振蕩培養箱中培養48 h，測定其OD600的平均值，確定菌株的耐鹽性。

1.6.3 碳源對菌株生長的影響。

配制分別由麥芽糖、葡萄糖、淀粉和蔗糖代替LB培養基中的碳源（酵母粉）的液體培養基，取等量細菌培養液接種于上述培養基中，至少做3個平行試驗，置于28? ℃下180 r/min恒溫振蕩培養箱中培養48 h，分別測定不同碳源下菌液OD600。

1.7 固氮菌對植物病原真菌的抑制活性

采用平板對峙法［11-12］研究固氮菌對植物病原真菌的抑制活性。將病原菌菌餅接種于PDA瓊脂平板（d=8.5 cm）中央，在距離菌餅兩側3 cm處劃線接種菌株，將接種后的培養皿在28? ℃恒溫培養箱中倒置培養5 d，同時接種只含有病原真菌的PDA瓊脂平板作為對照。用十字交叉法測量菌落直徑，根據以下公式計算菌絲生長抑制率：菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-對峙板菌落直徑） /對照菌落直徑 × 100%。

2 結果與分析

2.1 固氮菌的分離及鑒定

從茄子葉際分離到1株能在Ashby無氮培養基上生長較快的菌株。經過5代的分離純化后，其菌落為圓形半透明，邊緣整齊，表面濕潤，不易挑起，能夠產生黏液。在顯微鏡下觀察為棒桿狀（圖1）。通過擴增固氮酶基因nifH進行復篩，擴增得到大小約為360 bp的基因片段（圖2），與預期結果一致，將其編號為QZ-1。運用ELISA法測定其固氮酶活性，菌株QZ-1的固氮酶活性為78.79 IU/L，結合nifH基因擴增和固氮酶活性測定確定菌株QZ-1具有固氮能力。菌株QZ-1的16S rDNA序列1 437 bp，序列提交至GenBank數據庫，登記號為ON778565。在數據庫中進行BLAST比對發現，菌株QZ-1和克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae親緣關系最近，聚為一支，序列相似度大于99%，因此將QZ-1命名為Klebsiella sp.QZ-1（圖3）。

2.2 固氮菌的培養特性

2.2.1 pH對菌株生長的影響。

從圖4可以看出，菌株QZ-1在pH為5.0～9.0時生長較好，生長速率隨pH的增大呈減小趨勢，在pH為5.0時OD600達到最大，說明克雷伯氏菌對pH有較強的酸堿適應性。在pH為6.0時比pH為8.0時生長狀況好，說明菌株QZ-1為中性偏酸菌。

2.2.2 NaCl濃度對菌株生長的影響。

菌株QZ-1在0～4% NaCl濃度下均能生長，說明菌株有較廣的鹽度適應性。菌株的生長速率隨NaCl濃度的增大而減小，在NaCl濃度為0時，OD600達到最大，NaCl濃度為4%時，OD600最小（圖5）。由此可見，該菌株的最佳NaCl濃度為0，較為適宜的NaCl濃度為0～3%。

2.2.3 碳源對菌株生長的影響。

當LB培養基中的酵母粉被淀粉、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖替代后，菌株QZ-1對各碳源均能利用，但是酵母粉被替代后生長狀況不好，在培養48 h后，以淀粉為碳源的菌液OD600最高（1.32），遠低于在LB培養基中OD600（2.73），說明酵母粉為菌株的最佳碳源（圖6）。

2.3 固氮菌對植物病原真菌的抑制活性

菌株QZ-1具有廣譜抗真菌活性，對多種植物病原菌的抑制率從大到小依次為油菜菌核病菌（63.53%）、葡萄炭疽病菌（57.14%）、番茄灰霉病菌（48.75%）、稻瘟病菌（33.33%）、棉花立枯病菌（31.91%）、蘋果輪紋病菌（21.88%）、棉花枯萎病菌（22.22%）、黃瓜灰霉病菌（8.57%），可見，其對油菜菌核病菌、葡萄炭疽病菌、番茄灰霉病菌活性的抑制效果較好，對黃瓜灰霉病菌活性的抑制效果最弱。與對照組相比，各試驗組的抑菌圈邊界清晰，抑菌圈周圍菌絲生長緩慢（圖7）。

3 討論與結論

自生固氮菌可以獨立進行固定空氣中分子態氮，促進植物生長，增加農作物產量，在農業生產中發揮重要作用。植物葉際存在高水平的碳水化合物和碳氮比，營養物質豐富，存在廣泛的固氮作用，在自然條件下已經發現菊科、禾本科、十字花科、薔薇科、杜鵑科、榆科等科的植物葉際具有較高的固氮酶活性［2-3］。人工接種葉面固氮菌可以達到增產增收的效果，大豆噴施葉面固氮菌的增產率可達13%以上，玉米在苗期和孕穗期噴施葉際固氮菌可增產10%以上［4］。自生固氮菌因其不與植物形成宿主關系且適應能力強，具有增加農作物產量以及綠色環保等優點，已成為21世紀新型肥料發展的重要方向之一。

該研究從茄子葉際分離到一株自生固氮菌QZ-1，經16S rDNA序列比對分析鑒定為Klebsiella屬，將其命名為Klebsiella sp.QZ-1。據研究報道，克雷伯氏菌屬的一些種類是重要的條件致病菌和醫源性感染菌，大部分克雷伯氏菌基因組可檢測出固氮基因nif，說明該屬細菌具有固氮的遺傳基礎，對植物的生長及代謝起著間接的促進作用，在農業生產中可作為一種綠色菌肥［13］。羅霆等［14］從甘蔗根系分離篩選到1株克雷伯氏固氮菌，其固氮百分率可達29.2％。李樹品等［15］和黃磊等［16］從小麥根系分離得到3株具有高固氮酶活性的克雷伯氏菌。韓梅等［17］從玉米中分離的內生固氮菌克雷伯氏菌（K.trevisan），具有促進玉米生長的作用。該研究分離的自生固氮菌QZ-1在碳源氮源的利用方面基本與同屬的固氮菌利用情況相似，在淀粉為碳源或者無氮條件下都能生長良好，能耐受低濃度的鹽類，在偏酸（pH 5.0）的環境下生長良好，而現階段報道的菌株適應的pH為5.5～7.2，該試驗篩選菌株與一般的在酸性環境下難以生存的菌株形成差異，在菌肥應用中能更好地用于不同酸堿度的土壤，因此可以更廣泛地應用在農業生產中。

克雷伯氏菌作為生防菌，對多種植物病原真菌均有抑菌活性。如Park等［18］研究發現產酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）可防治胡蘿卜軟腐病。從石斛上分離到一株內生細菌（K.variicola）可防治由鏈格孢引起的煙草赤星病、甘藍黑斑病和番茄早疫病等［19］。該研究中分離的菌株Klebsiella sp. QZ-1具有廣譜抗真菌活性，對油菜菌核病菌、葡萄炭疽病菌、番茄灰霉病菌抑制效果可達40%以上。因此，自生固氮菌QZ-1的篩選為葉際固氮菌的研究提供了微生物資源，由于克雷伯氏菌繁殖速度快，對環境的適應能力強，具有固氮和生防作用，繁殖過程中能夠產生黏液，易于在植物葉際定殖等優點，可望高效地應用于固氮菌劑中進行資源化利用。

參考文獻

［1］VORHOLT J A.Microbial life in the phyllosphere ［J］.Nat Rev Microbiol，2012，10（12）：828-840.

［2］ 潘建剛，呼慶，齊鴻雁，等.葉際微生物研究進展［J］.生態學報，2011，31（2）：583-592.

［3］ 沙小玲，梁勝賢，莊緒亮，等.植物葉際固氮菌研究進展［J］.微生物學通報，2017，44（10）：2443-2451.

［4］ 王楠，李剛強，李云龍，等.固氮類芽孢桿菌的分離鑒定及其促生、抑菌活性的測定［J］.中國農業科技導報，2019，21（5）：95-103.

［5］ GIRI S，PATI B R.A comparative study on phyllosphere nitrogen fixation by newly isolated Corynebacterium sp.& Flavobacterium sp.and their potentialities as biofertilizer［J］.Acta Microbiol Immunol Hung，2004，51（1/2）：47-56.

［6］ MWAJITA M R，MURAGE H，TANI A，et al.Evaluation of rhizosphere，rhizoplane and phyllosphere bacteria and fungi isolated from rice in Kenya for plant growth promoters［J］.SpringerPlus，2013，2：1-9.

［7］奚輝，陳喜靖，景金富，等.滴灌施肥對秋茄子生長、產量及品質的影響［J］.浙江農業科學，2015，56（7）：1000-1001，1003.

［8］ 焦永剛，郭敬華，董靈迪，等.生物菌肥對土壤生態環境改良效果［J］.北方園藝，2017（13）：135-139.

［9］ 李瑞芳，趙玉峰，薛雯雯，等.一株芽孢桿菌16S rRNA 的基因序列測定和系統進化分析［J］.廣東農業科學，2011，38（3）：121-122，125.

［10］ RSCH C，MERGEL A，BOTHE H.Biodiversity of denitrifying and dinitrogenfixing bacteria in an acid forest soil ［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68（8）：3818-3829.

［11］ 王家和.煙草根病拮抗真菌的分離與篩選［J］.中國生物防治，1998，14（1）：28-31.

［12］ 馮蓉，劉麗，陳海念，等.解淀粉芽孢桿菌F11抗真菌活性研究［J］.農業資源與環境學報，2021，38（5）：849-857.

［13］ 李夢嬌，彭晟，徐紹忠，等.克雷伯氏菌在農業與環境治理上的應用［J］.生物技術進展，2014，4（6）：415-420.

［14］ 羅霆，歐陽雪慶，楊麗濤，等.1株有固氮能力的甘蔗克雷伯氏菌的分離鑒定及固氮特性［J］.熱帶作物學報，2010，31（6）：972-978.

［15］ 李樹品，蔣千里，楚杰，等.產酸克雷伯氏桿菌（klebsiella oxytoca）的分離及其特性研究［J］.山東科學，1991，4（3）：19-25.

［16］ 黃磊，石萬瑜，董紹佩，等.小麥根系克雷伯氏桿菌的分離與鑒定［J］.新疆農業科學，1990，27（1）：27-28.

［17］ 韓梅，羅培宇，肖亦農，等.玉米內生固氮菌的分離鑒定及其促生長作用研究［J］.沈陽農業大學學報，2010，41（1）：94-97.

［18］ PARK M R，KIM Y C，LEE S，et al.Identification of an ISRrelated metabolite produced by rhizobacterium Klebsiella oxytoca C1036 active against softrot disease pathogen in tobacco［J］.Pest Manag Sci，2009，65（10）：1114-1117.

［19］ 李祖紅，曾嶸，文國松，等.一株植物內生細菌SH-1及其應用：CN201310383464.0［P］.2014-01-01.