農作物種子核酸真空抽濾快速提取方法的研究

摘要：為解決轉基因檢測中植物種子核酸提取步驟多、效率低的難題，發(fā)明了非接觸式連接裝置，組裝了真空抽濾快速提取裝置，改進了核酸提取方法。該方法提取的種子核酸質量和濃度符合需求，核酸完整性好、無降解、無擴增抑制物，有效解決了種子樣品核酸快速提取的技術難題。對轉基因玉米Bt11的檢測結果表明，該核酸提取方法適用于農作物種子的轉基因檢測。

關鍵詞：核酸提取；分子檢測；種子；真空抽濾

Research on Vacuum Filtration Method in Rapid Extraction of

Nucleic Acid from Crop Seeds

ZHANG Haibo，ZHANG Hongjun，LEI Jun，ZHANG Ying

（Shaanxi Seed Working Station，Xi’an 710018）

分子檢測方法越來越多地應用于農作物種子的轉基因成分和品種真實性檢測項目中，這些方法通常以核酸檢測為主，以PCR擴增為核心[1]。PCR擴增的首要步驟是核酸提取。因為有細胞壁，植物的核酸提取不同于動物組織，過程比較復雜，尤其是農作物種子干物質較多，核酸提取更為困難[2]。種子核酸提取是進行PCR擴增的基礎，是獲得高質量檢測結果的前提，但因其步驟多且費時長，也是整個方法的限速步驟。

目前農作物種子主流的核酸提取方法需要用到十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、飽和酚、氯仿等化學試劑，這些試劑對人體有毒有害，不宜長期使用。商業(yè)化試劑盒法多采用離心過濾柱式，提取時間長、操作復雜，難以對大批量樣品進行核酸提取，且產生的離心管等垃圾較多。堿煮法雖然快速，但是核酸質量不高，且不易保存，無法進行復檢[3]。

為解決核酸快速高效提取問題，本研究發(fā)明了一種用于核酸抽濾的非接觸式連接裝置[4]，改進了核酸提取真空抽濾技術。該技術快速、簡便、可操作性好、實用性強，能夠使PCR技術在農作物種子分子檢測中得到更為廣泛的普及和推廣。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗中玉米、小麥和水稻的種子為陜西省農作物種子檢驗站收藏，轉基因玉米粉末Bt11（ERM-BF412BK）由歐洲標準局（IRMM，Institute for reference materials and measurements）制作，并通過上海安譜實驗科技股份有限公司購買。

吸附柱法植物核酸提取試劑盒（MolPure Plant DNA Kit）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司（Yeasen Biotechnology），實時熒光PCR擴增試劑（Pro Taq HS預混型探針法qPCR試劑盒AG11704）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，擴增引物和探針由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 核酸抽濾快速提取法 核酸抽濾快速提取使用吸附柱法植物核酸提取試劑盒提供的試劑，其中洗脫和離心步驟由本研究設計的真空抽濾方法代替。具體提取步驟如下：將種子樣品磨碎，稱取100mg放入2mL離心管中，加入400μL裂解液和5μL RNase，混勻后60℃加熱10min，期間混勻數(shù)次；加入130μL去蛋白液，混勻后12000r離心5min；取上清400μL，加入600μL結合液，混勻加入吸附柱中；將吸附柱通過發(fā)明的連接裝置與真空抽濾提取系統(tǒng)連接，打開真空泵，待液體全部吸入真空腔中后，加2次漂洗液漂洗；將吸附柱取下，12000r離心2min，恒溫震蕩儀烘干5min，加入洗脫液200μL，12000r離心1min，獲得的溶液為所提取的核酸。

1.2.2 試劑盒提取方法 利用吸附柱法植物核酸提取試劑盒提取試驗材料的核酸，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書，其中起始種子材料的質量以及最終的核酸洗脫液體積與核酸抽濾快速提取法保持一致，以便將兩種核酸提取方法所提取核酸的質量進行比較。

1.2.3 核酸質量檢測 提取的核酸使用紫外分光光度計ND2000（賽默飛世爾科技公司，Thermo Fisher Scientific）測定核酸的純度和濃度，核酸純度由260nm吸光值和280nm吸光值的比值判定，1.6～2.0為符合要求。核酸濃度由260nm吸光值計算，260nm吸光值為1.0表明核酸濃度為50ng/μL。使用8g/L瓊脂糖凝膠電泳和EB染色檢測核酸樣品的完整性，沒有嚴重拖尾表明提取的核酸未降解，符合試驗要求。

1.2.4 內源基因PCR擴增 采用GB/T 19495.4—2018《轉基因產品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法》中的方法，根據(jù)玉米、小麥和水稻的內源基因zSSIIb、Wx012和SPS基因檢測方法，分別合成Taqman探針實時熒光PCR的引物。Taqman探針實時熒光PCR擴增條件及擴增程序依據(jù)上述執(zhí)行標準執(zhí)行。擴增使用ABI StepOne Plus實時熒光PCR儀（美國Applied Biosystems）進行，使用儀器自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 轉基因玉米檢測分析 采用農業(yè)部2122號公告—14—2014《轉基因植物及其產品成分檢測 抗蟲和耐除草劑玉米Bt11及其衍生品種定性PCR方法》中的轉基因玉米Bt11檢測方法，合成Bt11內源基因和轉化體特異性檢測的Taqman探針和實時熒光PCR引物。對使用核酸抽濾快速提取方法提取的標準物質轉基因玉米Bt11的核酸進行實時熒光檢測。Taqman探針實時熒光PCR擴增條件及擴增程序依據(jù)上述執(zhí)行標準執(zhí)行，擴增循環(huán)數(shù)為45個循環(huán)，擴增使用ABI StepOne Plus實時熒光PCR儀進行，使用儀器自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 核酸抽濾快速提取裝置 為改良離心過濾柱式提取時間長、操作復雜、產生垃圾多等問題，本研究首先設計了一種用于核酸抽濾的非接觸式連接裝置。該連接裝置結構示意圖如圖1所示。該裝置由連接管和吸附柱組成，連接管的下端固定連接有連接頭，與真空腔連接。吸附柱的外側設有連接部，與連接管螺紋槽連接，連接頭的下端內側設有密封圈，連接管的內側設有單向閥，防止逆流。在第二堵蓋的背面增設帶有軟磁層的打標槽，可以方便利用軟磁層磁吸帶有標簽紙的鐵片，利用標簽紙可以方便對對應使用的連接管進行打標。當連接管重復使用時，可以方便地將對應的標簽紙鐵片取下更換，不需要按照傳統(tǒng)的方式直接將標簽紙粘在連接管上，避免更換撕揭不便等問題。

利用圖1的非接觸式連接裝置，聯(lián)合使用真空腔和真空泵，組建了核酸抽濾快速提取裝置，詳見圖2示意圖。核酸抽濾快速提取裝置由非接觸式連接裝置、真空腔和真空泵3部分組成。真空腔頂部每排有10個小孔，可同時插10個非接觸式連接裝置，下部有廢液口。真空腔通過連接軟管與真空泵連接。真空泵可提供-760mmHg的真空度，考慮到整個裝置的氣密性，一般使用時達到-600mmHg的真空度時即可實現(xiàn)真空抽濾。

2.2 核酸質量分析 使用試劑盒提取法和核酸抽濾快速提取法分別提取玉米、水稻和小麥粉末樣品各10份，其中玉米樣品標記為1～10號，水稻樣品為11～20號，小麥樣品為21～30號。核酸質量和核酸濃度測定結果分別如圖3和圖4所示。

對于核酸質量，A260/280的比值在1.6～2.0之間的為核酸質量合格，可用于種子的分子檢測。試劑盒提取法獲取的玉米、水稻和小麥核酸A260/280A260/280的比值中位值分別是1.77、1.75、1.79，核酸抽濾快速提取法獲取的玉米、水稻和小麥核酸A260/280的比值中位值分別是1.74、1.76、1.73。從圖3可以看出，試劑盒法和快速提取法獲得的核酸，A260/280的比值都在1.6～1.9之間，符合分子檢驗要求。兩組數(shù)據(jù)無顯著差異，說明兩種方法提取的核酸質量無較大差別。由圖4可知，提取的玉米、水稻、小麥核酸濃度分別在62.5～83.0ng/μL、56.0～82.0ng/μL、53.0～83.5ng/μL之間，中位值分別是66.0ng/μL、67.0ng/μL和66.0ng/μL，符合檢測要求。

2.3 核酸完整性分析 使用0.8%的瓊脂糖對提取的核酸進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖5所示。從圖中可以看出，采用核酸抽濾快速提取法提取的玉米、水稻和小麥的核酸在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳試驗中亮度高、彌散少、無拖尾，說明提取的核酸量足、降解少、大小一致，滿足進行下一步轉基因成分分析的要求。

2.4 內源基因擴增結果 使用實時熒光PCR方法，對核酸抽濾快速提取法提取的核酸進行內源基因擴增，結果如圖6所示。從圖中可以看出，玉米、水稻和小麥的內源基因zSSIIb（圖6A）、SPS（圖6B）和Wx012（圖6C）都能夠得到完整擴增，Ct值（循環(huán)閾值）在24～26之間，說明提取的玉米、水稻和小麥核酸不存在擴增抑制物，適合進行轉基因成分的PCR檢測。

2.5 轉基因玉米Bt11檢測結果分析 以轉基因玉米Bt11的標準物質為檢測對象，應用核酸抽濾快速提取方法提取核酸。分別對玉米內源基因zSSIIb和Bt11轉化體特異性片段進行實時熒光擴增，結果如圖7所示。轉基因玉米Bt11內源基因zSSIIb（圖7A）和Bt11轉化體（圖7B）特異性片段都擴增出了典型的S型擴增曲線，Ct值分別是24.33和24.26。檢測結果表明，本研究建立的核酸抽濾快速提取方法適合進行轉基因作物的核酸提取和實時熒光檢測。

3 討論與結論

核酸提取是植物轉基因檢測的基礎性、關鍵性環(huán)節(jié)，核酸質量的高低直接影響轉基因檢測結果的準確性[5]。為了提高轉基因檢測中核酸提取的速度和通量，本研究用真空抽濾方法代替離心的方法，改進了核酸提取技術，發(fā)明了非接觸式連接裝置，組裝了核酸抽濾快速提取裝置。經(jīng)測定，提取的種子核酸A260/280比值在1.6～2.0之間，濃度中位值分別是66.0ng/μL、67.0ng/μL和66.0ng/μL。0.8%的瓊脂糖電泳提示核酸完整度好，無降解拖尾。內源基因擴增表明提取的核酸無擴增抑制物。使用非接觸式連接裝置，避免了樣品之間產生污染，有利于種子轉基因檢測結果質量控制[6]。

核酸抽濾快速提取技術解決了實驗室種子檢測中提取種子樣品核酸的技術難題。由于使用了真空抽濾技術，核酸提取步驟由原來的14步減少為7步，一次提取所用時間由原來的142min縮短到58min，所需時間減少約60%，效率提升140%以上。該方法減少了提取環(huán)節(jié)，提高了核酸提取的效率和通量，保證了提取純度。使用了非接觸方式抽濾，使離心管和廢液收集管可重復使用，節(jié)約了實驗耗材，克服了樣品間易污染的難題，可高效助力種子分子檢測。

參考文獻

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[2] 陳欲，汪小福，陳笑蕓，彭城，徐俊鋒，李玥瑩．基因組DNA快速提取及在轉基因大豆檢測中的應用．中國油料作物，2021，43（1）：70-76

[3] 權永兵，黃永輝，徐淼鋒，廖力，林偉，張衛(wèi)東．改良十六烷基三甲基溴化銨-磁珠核酸提取方法及在植物轉基因檢測中的應用．食品安全質量檢測學報，2019，10（23）：8042-8047

[4] 張英，張海波，雷軍，忽瑞，楊娟妮，劉冰，馬亞琴，陳西．一種用于核酸抽濾的非接觸式連接裝置．中國：CN202320076389．2，2023-

05-02

[5] 羅建興，劉國強，呼李樂，郭梁．轉基因作物檢測技術研究進展．食品安全質量檢測學報，2023，14（15）：139-148

[6]雷軍，茍飛凡，張海波．種子轉基因檢測實驗室污染原因排查和分析應對．中國種業(yè)，2023（7）：26-30

（收稿日期：2024-10-12）