牛源肺炎克雷伯氏菌的生物學特性研究※

●李 彬 彭樹德 白和平 吳同壘 史秋梅

（1. 秦皇島撫寧區農業農村局 河北 秦皇島 066004；2.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心 河北 唐山 063000；3.河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室 河北 秦皇島 066004；4.唐河縣和杰農業專業合作社 河南 南陽 473000）

肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏陰性、需氧、無動力桿菌，是一種條件性致病菌，屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬。克雷伯氏菌是一種重要的人畜共患條件性致病菌，長期存在于動物腸道及上呼吸道，通常在機體免疫力低下時或環境條件發生改變時引起繼發性感染，近年來陸續報道出該菌引起不同動物源性疾病[1]。2021 年11 月河北秦皇島某奶牛養殖場出現母牛化膿性乳房炎及犢牛呼吸道癥狀，從臨床樣品中分離出2 株致病性肺炎克雷伯氏菌，本研究通過莢膜型血清型分型、毒力基因與耐藥基因檢測以及藥物敏感性試驗，研究牛源肺炎克雷伯氏菌的生物學特性，以期為該病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

LB 培養基，均購自北京陸橋；PCR 試劑均購自天根公司；抗生素藥敏紙片（大觀霉素、多粘菌素B、環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、頭孢曲松、卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、乙酰甲喹、氟苯尼考、磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、頭孢拉定），均購自杭州微生物試劑有限公司；肺炎克雷伯氏菌基因組DNA，在河北省預防獸醫學重點實驗室提取、保存。

1.2 引物設計與合成

合成肺炎克雷伯氏菌K1、K2、K5、K20、K54、K57 等6 種主要莢膜血清型鑒定引物；毒力基因黏附素（mrkD、FimH、UreA、allS）、脂多糖（WabG）、莢膜多糖生成調節基因（RmpA、MagA）、鐵載體基因（Aerobactin、Uge）特異性鑒定引物，耐藥基因碳青霉烯酶（KPC、OXA、NDM）、產頭孢菌素β-內酰胺類酶（DHA）、產超廣譜β-內酰胺類酶（CTX-M1、TEM）特異性鑒定引物。由上海生工生物科技有限公司合成[2-4]。

1.3 試驗方法

1.3.1 莢膜血清型檢測采用PCR 法擴增K1、K2、K5、K20、K54、K57 等6 種主要莢膜血清型，PCR 反應體系為：2×Tqmaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，超純水7 μL。PCR反應條件為95℃預變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃終延伸10 min。取擴增產物5 μL，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小符合目標條帶大小即為陽性。

1.3.2 毒力基因與耐藥基因檢測采用PCR 法檢測分離菌的毒力基因與耐藥基因，PCR 體系為2×Taq PCR MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物1 μL（終濃度為10 μmol/L）、模板各1 μL，同時設置陰性對照。PCR 條件為：95℃ 5 min；95℃45 s， 50℃ 45 s，72℃ 1 min，30 個 循 環；72℃10 min。PCR 結 束 后 取 擴 增 產 物5 μL，經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶符合預期即判斷為陽性。

1.3.3 藥敏試驗藥敏試驗參照美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）所述的 K-B 紙片法進行抗生素藥敏試驗，取過夜培養的菌液200 μL 均勻涂布于LB 瓊脂培養基，干燥3～5 min，將藥敏紙片貼在培養基表面，37℃培養箱倒置培養24 h，觀察抑菌情況，測量抑菌圈直徑，并根據美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）抗菌藥物敏感性實驗執行標準（CLSI-M100-S19）判斷該分離菌對藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 莢膜血清型檢測結果

采用PCR 法檢測肺炎克雷伯氏菌的主要血清型，獲得血清型特異性基因大小為640 bp（圖1），與肺炎克雷伯氏菌血清型K2 特異性基因的大小一致，說明本次分離的2 株肺炎克雷伯氏菌均為K2 型。

2.2 毒力基因與耐藥基因檢測結果

對分離菌株進行肺炎克雷伯氏菌的9 種毒力基因的PCR 檢測結果，見表1。

由表1 可知，兩株分離菌均攜帶黏附素（mrkD、FimH）脂多糖（WabG）毒力基因；另外kp-1 株攜帶鐵載體基因（Aerobactin），kp-2 不攜帶。

耐藥基因檢測結果，見表2。

表2 耐藥基因檢測結果

由表2 可知，分離菌株攜帶產頭孢菌素β-內酰胺類酶（DHA-1）、產超廣譜β-內酰胺類酶（TEM、SHV），此外kp-1 株攜帶碳青霉烯酶（KPC）耐藥基因。

2.3 藥敏試驗

藥敏試驗結果，見表3。

表3 抗生素藥敏試驗結果

由表3 可知，2 株分離菌均對大觀霉素敏感，對多粘菌素B、環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、卡那霉素、新霉素、氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、乙酰甲喹中敏，對氟苯尼考、磺胺間甲氧、磺胺二甲氧耐受。其中菌株kp-1 對頭孢曲松中敏，對頭孢拉定耐受；菌株kp-2 對頭孢曲松敏感，對頭孢拉定中敏。

3 討論與結論

王哲紅[5]在新疆地區集約化牛場進行該菌檢測，其中鼻拭子樣本檢出率為11.52%（57/495），肛拭子檢出率為28.46%（150/527）；賈麗等[6]在肺炎克雷伯菌所致奶牛肺炎的病原分析及治療的研究中，從84 份鼻拭子樣品中分離到32 株肺炎克雷伯菌，檢出率為38.1%（32/84）；買爾哈巴·吾斯曼[7]對我國部分省市規模化奶牛養殖場收集患乳腺炎奶牛的奶樣進行肺炎克雷伯菌的檢測，檢出率達26.5%（131/495）；Katsande 等[8]的研究顯示肺炎克雷伯菌占奶牛乳腺炎細菌病原的15.5 %；Aslan 等[9]研究證實肺炎克雷伯氏菌占呼吸道細菌性疾病的20%。以上結果表明了國內外牛源性肺炎克雷伯氏菌的高分離率及致病率。

近年來，由于抗生素的不合理使用，導致菌株耐藥性不斷增強，有多重耐藥表現，耐藥性的增強主要由于兩個方面，一方面是耐藥基因的垂直傳播，傳給下一代；另一方面是基因重組到質粒上，通過轉導、轉化、接合的方式傳播其耐藥基因。本研究耐藥基因檢測顯示分離菌攜帶TEM、SHV、DHA-1、KPC耐藥基因，表明分離菌可能具有進行種內或種間傳播以上幾種耐藥基因的能力。此外耐藥基因檢測結果與耐藥表型不完全一致，這可能由于養殖場日常使用抗生素較多，藥物間相互作用，抑制了相關耐藥基因的表達，也可能是耐藥基因發生突變導致具有同種耐藥基因的菌株，對同種抗生素表現的耐藥性不同。目前，疫苗被認為是控制傳染性疾病的有效手段，但肺炎克雷伯氏菌具有較多血清型，這可能是目前該病原菌性疫苗尚未上市的原因之一，鑒于此對肺炎克雷伯氏菌的日常防控顯得尤為重要。