ICG-001對食管鱗癌細胞增殖的抑制作用及其分子機制

史建紅，陳丁雄，盧曉童，郝佳潔，蔡 巖，王明榮，張 鈺

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院，分子腫瘤學國家重點實驗室，北京 100021)

食管癌是常見的消化系統惡性腫瘤，我國是世界上食管癌發病率和死亡率最高的國家。統計數據顯示，2016年食管癌的發病數和死亡數分別位居我國惡性腫瘤的第6 位和第4 位[1]。食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國食管癌的主要病理類型，其預后差，死亡率高，多年來中晚期患者術后的5年生存率一直徘徊在15%～25%[2]。目前臨床上尚缺乏可高效治療ESCC 的藥物，因此迫切需要尋找新的有效藥物。

Wnt/β-catenin 信號通路在細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移、上皮-間質轉化和腫瘤干細胞的自我更新等過程中發揮重要作用[3]。既往研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活與ESCC、肝癌和結直腸癌等實體腫瘤及血液系統惡性腫瘤的發生、發展及預后密切相關[4-7]，提示Wnt/β-catenin信號通路是相關惡性腫瘤治療的潛在靶點。ICG-001 是Wnt/β-catenin信號通路的一種小分子抑制劑，主要通過競爭性結合CREB 結合蛋白(creb-binding protein，CBP)從而干擾CBP 與β-catenin 的相互作用，由此抑制β-catenin/TCF 對下游靶分子的轉錄活化[8]。目前，已有多項研究證實ICG-001 可顯著抑制結直腸癌、胰腺導管腺癌、唾液腺腫瘤和急性淋巴細胞白血病等多種惡性腫瘤細胞在體內、外的增殖能力[8-11]。然而，ICG-001 在ESCC 中的作用目前尚無文獻報道。因此，本研究檢測分析了ICG-001 對ESCC 兩種細胞系KYSE410和KYSE450細胞增殖能力、細胞凋亡及周期分布的影響，并通過檢測相關分子的mRNA 和蛋白表達水平的變化探討其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

細胞培養基RPMI-1640 為Cell Technology 公司產品。胎牛血清購自Newzerum公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自美侖生物公司。Opti-MEM 培養基購自Gibco 公司。Lipofectamine 2000 轉染試劑、BCA 蛋白定量試劑盒、ECL 化學發光檢測試劑購自Thermo Fisher Scientific 公司。CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒均購自日本同仁化學公司。細胞RNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物公司。TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa 公司。HiFiScript cDNA 合成試劑盒購自北京康為世紀公司。SKP2、Survivin和TCF4抗體購自CST 公司，GAPDH 抗體購自Proteintech 公司。DMSO購自Sigma 公司。抑制劑ICG-001 購自Selleck 公司。電泳儀和實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)儀購自Applied Biosystems 公司。濕轉轉膜儀購自Tanon 公司。酶標儀購自Bio Tek Instrument公司。化學發光成像儀購自Beckman公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 食管鱗癌細胞系KYSE410 和KYSE450購自南京科佰生物公司，均使用添加10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養基，置于CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中37 ℃進行培養。

1.2.2 細胞增殖實驗 在96孔板中每孔接種3000個對數生長期的細胞，每組設3 個平行復孔。待細胞完全貼壁后，分別用25、50和100 μmol/L的ICG-001處理細胞24 和48 h 后使用CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖活力，獲得D(450)值，以DMSO 處理細胞作為對照組，并按以下公式計算細胞增殖率。

1.2.3 平板集落形成實驗 在6 孔板中每孔接種1000個對數生長期的細胞，并分別用50和100 μmol/L的ICG-001處理KYSE410和KYSE450細胞進行平板集落形成實驗。每組設3 個平行復孔。當出現肉眼可見的克隆時，終止培養，甲醇固定后用0.5%結晶紫染液染色并計數。

1.2.4 細胞周期檢測 分別使用50 和100 μmol/L 抑制劑ICG-001 處理KYSE410 和KYSE450 細胞24 h 后收集細胞沉淀，用70%乙醇固定過夜，用含RNA酶的PI染色，使用流式細胞儀進行檢測，并用Modifit軟件進行數據分析，以DMSO處理細胞作為對照組。

1.2.5 細胞凋亡檢測 細胞分組同1.2.4。使用抑制劑ICG-001處理48 h后收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。使用流式細胞儀進行檢測，用Flowjo.10軟件作圖。

1.2.6 qPCR 檢測 細胞分組同1.2.4。ICG-001 處理24 h 后收集細胞，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，使用HiFiScript cDNA 合成試劑盒合成cDNA。使用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒及ABI Quant-Studio 5 PCR儀進行qPCR實驗。qPCR 20 μL擴增體系為：cDNA 模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX 染料II 0.4 μL，2×TB Green 10 μL，RNase-Free 水6.8 μL。qPCR 反應程序：95 ℃、30 s；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，40 個循環；60 ℃、1 min→95 ℃、15 s。以GAPDH基因mRNA 表達水平為參照對數據進行歸一化處理，采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。引物使用Primer Premier 5.0軟件設計后由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，引物序列(5′-3′)如下：Survivin，F-GCCCAG TGTTTCTTCTGCTT，R-TCCGCAGTTTCCTCAAATTC；SKP2，F-ATGCCCCAATCTTGTCCATCT ，R-CACCGA CTGAGTGATAGGTGT；GAPDH，F-ACCCACTCCTCCA CCTTTGA，R-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA。

1.2.7 蛋白提取和Western blot 檢測 ICG-001 處理24 h后收集細胞，使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細胞提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。按照常規方法進行SDS-PAGE 電泳并轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h 后加入一抗4 ℃孵育過夜。一抗包括：β-catenin、SKP2、Survivin、TCF4 和GAPDH，使用5%脫脂牛奶按1∶1000 進行稀釋。使用洗滌緩沖液TBST洗滌3次，每次8 min，加入對應種屬的二抗(5%脫脂牛奶按1∶5000 進行稀釋)，室溫搖床孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次8 min，配制ECL 發光液，使用Amersham Imager 800成像儀進行曝光，以GAPDH 作為內參對照。

1.3 統計學分析

應用SPSS Statistics 23.0 軟件對數據進行統計學分析，使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行圖片制作。用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進行多樣本均數的比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ICG-001抑制ESCC細胞的增殖活力

CCK-8 細胞增殖活力實驗結果顯示，ICG-001 處理24或48 h可抑制ESCC細胞系KYSE410和KYSE450的增殖活力，并呈劑量依賴性(P＜0.01，圖1)。

圖1 ICG-001處理24或48 h對ESCC細胞增殖活力的影響

2.2 ICG-001抑制ESCC細胞的集落形成能力

平板集落形成實驗結果顯示，50和100 μmol/L的ICG-001 處理48 h 可顯著抑制ESCC 細胞系KYSE410和KYSE450的集落形成能力(P＜0.01，圖2)。

圖2 ICG-001處理48 h對ESCC細胞集落形成能力的影響

2.3 ICG-001誘導ESCC細胞發生G0/G1期阻滯

流式細胞術分析結果顯示，KYSE410和KYSE450細胞經ICG-001 處理24 h 后，G0/G1 期細胞比例顯著增加，S 期和G2/M 期細胞比例相對降低(圖3)，提示ICG-001 可誘導ESCC 細胞發生G0/G1 期阻滯(P＜0.01)。同時，我們也檢測了ICG-001 處理細胞的凋亡情況，但未見到ESCC 細胞發生明顯凋亡(結果未展示)。

圖3 ICG-001處理24 h對ESCC細胞周期分布的影響

2.4 ICG-001對β-catenin通路相關分子表達的影響

qPCR 檢測結果顯示，在ICG-001 處理的ESCC 細胞中，β-catenin/TCF 下游靶分子SKP2 和Survivin 的mRNA表達水平與對照組相比顯著降低(P＜0.01)，而且可與β-catenin 結合的轉錄因子TCF4 的mRNA 表達水平也明顯降低(P＜0.01，圖4)。Western blot 檢測結果顯示，SKP2、Survivin和TCF4的蛋白表達水平均明顯下調(P＜0.01，圖5)。

圖4 ICG-001對β-catenin通路下游分子mRNA表達水平的影響

圖5 ICG-001對β-catenin通路相關蛋白表達的影響

3 討論

ICG-001 可以有效抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖。但迄今為止，ICG-001在ESCC中的作用尚無文獻報道。本研究結果顯示，ICG-001 處理可顯著抑制ESCC 細胞的增殖能力。這與以往研究在結腸癌、胰腺導管腺癌、胃癌、葡萄膜黑色素瘤和鼻咽癌細胞中所觀察到的現象一致[8-9，12-14]。我們進一步分析發現，ICG-001可誘導ESCC細胞發生G0/G1期阻滯，但并未見到明顯的細胞凋亡。與本文結果相似的是，Michael等[8-9，12]在胰腺導管腺癌、結腸癌和胃癌細胞中的研究結果也顯示ICG-001 可以誘導細胞發生G0/G1 期阻滯。同時，在胰腺導管腺癌細胞中ICG-001 也是主要通過誘導G0/G1 期阻滯抑制細胞增殖，但對細胞存活無明顯影響[9]。而在結腸癌和胃癌細胞中，ICG-001不僅可以誘導細胞周期阻滯，同時也誘發了明顯的細胞凋亡[8，12]。

既往文獻報道ICG-001可以抑制β-catenin 的轉錄活性[8]，為進一步探討ESCC 細胞中ICG-001作用的分子機制，我們檢測分析了ICG-001 處理細胞后β-catenin 通路相關分子的表達變化情況，發現β-catenin信號通路下游分子SKP2和Survivin的表達明顯下調。以往有多項研究顯示抑制SKP2 表達可導致G0/G1期阻滯[15-16]，本研究結果亦提示ICG-001可能通過下調SKP2 的表達將ESCC 細胞阻滯在G0/G1 期，但其作用的詳細機制還有待深入研究。另一方面，有研究顯示ICG-001 可通過下調Survivin 誘導結腸癌和多發性骨髓瘤細胞發生凋亡[8，17-19]。但是，在本研究和另一項關于胰腺導管腺癌的研究中，雖然ICG-001 處理下調了Survivin 的表達水平，但細胞并未發生明顯凋亡[9]。我們推測這兩類細胞中可能存在某些負反饋調節，但相關分子機制目前尚不清楚。

據文獻報道，β-catenin 可與TCF4 結合形成轉錄因子復合物激活SKP2和Survivin等靶基因的轉錄[9，20-21]。在本研究中，我們還發現ICG-001處理可導致轉錄因子TCF4 的mRNA 和蛋白表達水平明顯下調。因此，我們推測ICG-001 除了干擾β-catenin 和CBP 結合，還可能通過下調TCF4 的表達進而抑制β-catenin/TCF 復合物的功能，導致SKP2和Survivin的表達水平降低。目前，ICG-001對TCF4表達的影響尚未見到文獻報道，相關調控機制仍有待于進一步研究闡明。

綜上所述，本研究結果顯示，ICG-001 可顯著抑制ESCC 細胞的增殖潛能，提示ICG-001 可通過影響β-catenin/TCF 復合物的功能從而抑制下游靶分子Survivin 和SKP2 的表達，誘導細胞發生G0/G1 期阻滯進而抑制ESCC 細胞的增殖。目前臨床上缺乏療效顯著的ESCC 治療藥物，亟須研發有效的治療藥物和治療方案。本研究結果提示ICG-001 是潛在的ESCC 治療藥物，將其單獨或聯合其他治療手段有可能提高臨床療效。后續研究將進一步檢測ICG-001 對ESCC 細胞移植瘤增殖的抑制作用，在體內模型中驗證其治療潛力，以期為ESCC 的治療提供新的候選藥物及實驗依據。