脫-γ-羧基凝血酶原蛋白的原核表達(dá)與鑒定

龔呂鴻,徐 麗,劉雅楠,吳勝昔,許 東,秦 萍,韋廣苗,曾 鵬

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 重慶 400054;2.重慶市第七人民醫(yī)院, 重慶 400054)

0 引言

肝細(xì)胞癌(HCC)是肝細(xì)胞疾病,是世界上最具威脅性的癌癥之一,許多國(guó)家的新病例仍在迅速增加[1]。乙型肝炎病毒感染、過(guò)度飲酒和酒精性肝病等是HCC的主要危險(xiǎn)因素[2]。肝細(xì)胞癌侵襲性強(qiáng),發(fā)展迅速,預(yù)后效果差,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[3-4]。由于患者在疾病早期缺乏特定的癥狀和體征,一旦確診,大多已處于中期和后期階段。據(jù)報(bào)道,HCC患者的5年凈生存率為5%～30% ,且變化率很小[5]。如果能在早期發(fā)現(xiàn)并治療肝癌,則患者5年生存率可提高至70%[6]。因此研究HCC的早期檢測(cè)方法十分必要。

脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)是無(wú)基本的凝血功能的異常凝血酶原。Liebman等[7]首次報(bào)道DCP水平與HCC患者高度相關(guān)。DCP在診斷HCC方面的敏感性和準(zhǔn)確性要優(yōu)于傳統(tǒng)的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)診斷[8-9]。DCP與腫瘤的血管侵襲密切相關(guān)[10],在HCC預(yù)后中也有明顯作用[11]。因此,DCP在肝細(xì)胞癌的診斷、評(píng)估和預(yù)后等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[12]。

在保證原始DCP蛋白氨基酸序列正確的基礎(chǔ)上,優(yōu)化該基因密碼子,合成優(yōu)化后的CDS基因,并將其融合到pET28a(+)質(zhì)粒中,構(gòu)建pET28a(+)/DCP重組質(zhì)粒,再轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的BL21(DE3)中,利用Ni柱層析的原理對(duì)DCP蛋白進(jìn)行純化,并進(jìn)行生物特性檢測(cè)。研究目的是制備高純度、特異性好、成本低的DCP蛋白,為肝癌的早期檢測(cè)方法研究提供試劑參考。

1 材料

1) 菌株和質(zhì)粒:江蘇金唯智生物公司構(gòu)建pET28a(+)/DCP、質(zhì)粒pET28a(+),保藏于重慶理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2) 主要試劑及儀器:Glycine購(gòu)自碧云天公司;Imidazole購(gòu)自Genview公司;限制性內(nèi)切酶 NdeⅠ 和 XhoⅠ、10×QuickCut Green buffer購(gòu)自TaKaRa公司;NGCTM親和層析系統(tǒng)、Ni柱購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 DCP基因合成

查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)DCP基因的CDS序列(LX095963),將該序列委托金唯智生物公司進(jìn)行優(yōu)化密碼子宿主偏好性,在N和C端引入酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI,并融合質(zhì)粒自帶的His標(biāo)簽進(jìn)行合成。

2.2 pET28a -DCP重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測(cè)序

將合成的穿刺菌劃線平板培養(yǎng),選取單菌落于試管中活化12 h。用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。用NdeI、質(zhì)粒、XhoI、酶緩沖反應(yīng)液、超純水配制酶切體系,將上述混合系于37 ℃水浴中酶促反應(yīng)30 min,經(jīng)電泳檢測(cè)正確后送金唯智公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2.3 DCP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將活化的菌落擴(kuò)大培養(yǎng),當(dāng)菌液OD600值在0.6時(shí),加入IPTG誘導(dǎo)劑,30 ℃下誘導(dǎo)6 h。8 000 r/min ,12 min離心,棄上清,加入25倍菌重的裂解液,混合液超聲破碎15 min,10 000 r/min, 10 min,進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.4 DCP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

將活化的菌落擴(kuò)大培養(yǎng),并按1%的接種量接種于大瓶中30 ℃、180 r/min, OD600值達(dá)到0.6時(shí)取出。對(duì)溫度(16、25、30、37 ℃)、時(shí)間(2、4、6、8、10、12 h)、IPTG最終濃度(0.2 、0.4、0.6 、0.8、1.0 mmol/L)進(jìn)行篩選。收菌8 000 r/min,12 min,加入細(xì)菌裂解液和PMSF(1%菌重)用超聲機(jī)進(jìn)行破碎,離心條件為 11 000 r/min,10 min。收集固體和上清,與上樣緩沖液適量混勻,分別進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.5 DCP重組蛋白的純化

根據(jù)2.4篩選到的最佳條件,將菌液擴(kuò)大培養(yǎng),菌液配平后 8 000 r/min,10 min離心,棄上清,加入 25 倍菌重體積的PBS重懸后,再重復(fù)1次之前的步驟,加入相同體積的裂解液超聲破碎40 min,棄上清,加入裂解液和PMSF(1%菌重)后,4 ℃過(guò)夜攪拌。10 500 r/min,20 min離心,收集上清液,用0.22 μm進(jìn)口濾頭過(guò)濾備用。用NGCTM層析純化系統(tǒng)純化DCP 重組蛋白,具體操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[13],收集紫外吸收峰280 nm下的液體。

2.6 DCP重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

將上樣液、流穿液、各洗脫峰組分加入適當(dāng)體積的上樣緩沖液后,變性處理10 min,進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),完成后,進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色處理30 min,然后進(jìn)行過(guò)夜脫色處理,拍照。

2.7 DCP重組蛋白的Western Blot 檢測(cè)

將純化后得到的DCP蛋白樣品進(jìn)行電泳,待電泳畢,進(jìn)行切膠轉(zhuǎn)膜(100 V,70 min);待轉(zhuǎn)膜完成后,用現(xiàn)配的5%脫脂奶粉將膜封閉2 h。以DCP蛋白市售抗體(YRX201648M,無(wú)錫云翠生物科技有限公司)作為一抗(1∶10 000稀釋)4 ℃過(guò)夜,棄掉一抗,用TBST搖洗3次。按(1∶4 000)孵育酶標(biāo)IgG二抗1 h。加入等量混合的ECL化學(xué)發(fā)光顯色液,靜置反應(yīng)3 min,顯影。

3 結(jié)果與分析

3.1 pET28a(+)/DCP重組質(zhì)粒酶切鑒定及測(cè)序

將pET28a(+)/DCP重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切凝膠電泳,目的基因大小為1 875 bp與質(zhì)?；虼笮? 369 bp處有明顯印跡,基本切合預(yù)期目的片段及空載體(如圖1)。將pET28a(+)/DCP質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,顯示連接位點(diǎn)均正確。

M: 標(biāo)準(zhǔn)酶切MARKER; 1:DCP質(zhì)粒酶切檢測(cè)。

3.2 DCP重組蛋白表達(dá)鑒定

將合成的重組菌株和對(duì)照組(空載體)在進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后(同一條件)進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示,BL21空載體在目的蛋白印跡有少量表達(dá),重組菌株的沉淀組分在72 kD處有較多目的蛋白,而上清中較少(見(jiàn)圖2)。這切合預(yù)期的分子量,表明重組菌株pET28a(+)/DCP成功構(gòu)建,且主要以包涵體形式出現(xiàn)在沉淀組分中。

M:Marker; 2:空載體上清;3:空載體沉淀; 4:工程菌上清; 5:工程菌沉淀。

3.3 DCP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

為摸索DCP重組蛋白表達(dá)的影響因素,選取設(shè)定溫度(16、25、30、37 ℃)、時(shí)間(2、4、6、8、10、12 h)、IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)3個(gè)對(duì)蛋白表達(dá)有影響的因素進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè),結(jié)果圖3—5目的蛋白表達(dá)量最大的前提下,綜合3個(gè)主要因素得出,誘導(dǎo)條件為:溫度為30 ℃,IPTG終濃度為0.6 mmol /L,時(shí)間為6 h。

M:Marker 1、3、5、7、9:16 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃(1 mmol/L IPTG,6 h)誘導(dǎo)條件下DCP重組蛋白超聲破碎后上清;2、4、6、8:16 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃(1 mmol/L IPTG,6 h)誘導(dǎo)條件下DCP重組蛋白超聲破碎后沉淀。

M:Marker 1、3、5、7、9、11:0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG(25 ℃,6 h)誘導(dǎo)條件下DCP重組蛋白超聲破碎后沉淀;2、4、6、8、10、12:0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG(25 ℃,6 h)誘導(dǎo)條件下DCP重組蛋白超聲破碎后上清。

M:Marker 1、3、5、7、9:2、4、6、8、10、12h(25 ℃,0.8 mmol/L IPTG)誘導(dǎo)條件下DCP重組蛋白超聲破碎后沉淀;2、4、6、8、10、12 h(25 ℃,0.8 mmol/L IPTG)誘導(dǎo)條件下DCP重組蛋白超聲破碎后上清。

3.4 DCP重組蛋白的純化

將重組菌株pET28a(+)/DCP進(jìn)行LB平板培養(yǎng),然后進(jìn)行大量培養(yǎng)(最佳條件下);細(xì)菌溶液進(jìn)行前處理過(guò)夜,通過(guò)Ni柱進(jìn)行純化,按梯度濃度的洗脫液對(duì) DCP蛋白進(jìn)行脫洗。結(jié)果表明:DCP蛋白的紫外吸收峰280 nm能被100 mM和200 mM洗脫液洗脫下來(lái)。如圖6所示。

圖6 NGCTM層析系統(tǒng)純化DCP重組蛋白圖譜

3.5 DCP重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

取上樣液、流穿液、各280 nm吸收峰樣品進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖7,表明純化后的濃度較高部分的DCP蛋白能在100 mM被洗脫下來(lái)。

M:Markerv 1:上樣液;2:流穿液;3-4:50mM洗下雜蛋白;5-6:100mM洗下DCP蛋白 7-8: 200mM洗下DCP蛋白。

3.6 DCP重組蛋白的Western Blot 檢測(cè)

經(jīng)過(guò)Western Blot檢測(cè)表明,特異性蛋白條帶出現(xiàn)在72 kD處,而對(duì)照組沒(méi)有條帶,切合預(yù)期結(jié)果。說(shuō)明DCP蛋白已表達(dá)成功。

M:Marker;1: DCP 重組蛋白 2:pET28a(+)空載體沉淀組分。

4 結(jié)束語(yǔ)

肝癌在早期沒(méi)有特殊的癥狀表現(xiàn),中晚期才會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀,而此時(shí)的五年存活率極低,嚴(yán)重威脅人們的健康。因此,HCC的早期診斷非常重要。目前,在HCC的臨床初步檢測(cè)中,主要采用影像學(xué)檢查方法和血清學(xué)檢測(cè)方法[14]。血清學(xué)檢測(cè)最為方便,但臨床常用的血清標(biāo)志物AFP檢測(cè)[15]存在不足。DCP作為新的血清標(biāo)物,在特異性和準(zhǔn)確性方面均優(yōu)于AFP[9],且已納入中國(guó)肝癌診療規(guī)范[16],作為HCC早期的檢測(cè)指標(biāo)。同時(shí),DCP水平不僅與HCC的血管侵襲相關(guān),也是HCC治療結(jié)果預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)[17]。

在DCP蛋白基因CDS序列選擇pET28a(+)作為表達(dá)載體,并在上游端和下游端分別融合組氨酸標(biāo)簽后進(jìn)行 DCP重組蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)影響DCP蛋白表達(dá)的溫度、時(shí)間、IPTG濃度這3個(gè)因素中,25 ℃、IPTG濃度 0.8 mmol/L、誘導(dǎo)6 h時(shí),DCP重組蛋白表達(dá)量最高。在100 mM咪唑濃度下洗脫的蛋白含大量DCP目的蛋白,后續(xù)為提高目的蛋白的收率,可在更窄的咪唑梯度下洗脫,以達(dá)到提高目的蛋白純度的目的。也可純化之前進(jìn)行雜蛋白的初步分離,例如使用含有曲拉通的低濃度尿素溶液進(jìn)行洗滌。DCP重組蛋白在菌體內(nèi)形成包涵體,重組蛋白表達(dá)過(guò)快,使得蛋白不能正確地折疊,導(dǎo)致蛋白質(zhì)進(jìn)行非特異性結(jié)合[18],產(chǎn)生大量不溶性蛋白。本研究成功制備出純度較高的DCP蛋白,其生物活性良好,為后續(xù)DCP的檢測(cè)方法研究提供了參考。