基于多成分含量測定和化學(xué)計(jì)量學(xué)的不同基原白芷藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

石 歡，封 燮，常雅晴，張 丹，王 蕾，鄭玉光，鄭 倩，郭 龍*

1. 河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200

2. 河北省中藥資源利用與質(zhì)量評(píng)價(jià)國際聯(lián)合研究中心，河北 石家莊 050200

3. 河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050026

4. 石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊 050051

白芷是臨床治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛的常用中藥材。辛，溫；歸胃、大腸、肺經(jīng)；具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效。白芷為多基原藥材，《中國藥典》2020 年版收載白芷的兩個(gè)基原為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. 或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan 的干燥根[1]。市場中白芷藥材根據(jù)基原不同一般分為白芷和杭白芷藥材。目前，對于白芷藥材化學(xué)成分分析相關(guān)報(bào)道主要集中在指紋圖譜和含量測定方面。已有研究采用指紋圖譜和多成分含量測定方法對不同產(chǎn)地和不同采收期白芷藥材的化學(xué)成分及質(zhì)量進(jìn)行比較[2-3]。截止目前對于白芷藥材的兩種基原白芷和杭白芷的化學(xué)成分及質(zhì)量差異的研究未見報(bào)道，因此需要建立合理可行的分析方法對不同基原的白芷藥材進(jìn)行分析與比較，為不同基原白芷藥材的質(zhì)量控制提供方法和數(shù)據(jù)支撐。

白芷化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有香豆素、多糖、揮發(fā)油、生物堿、微量元素等成分[4-5]。研究表明香豆素類成分為白芷藥材的主要活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明，白芷藥材中含有的香豆素類成分，如歐前胡素、異歐前胡素等，具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗過敏、抑菌等多種藥理作用[6-9]。因此，對白芷和杭白芷藥材中活性香豆素類成分比較分析，將有助于全面地反映不同基原白芷藥材的差異，為白芷藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

因此，本研究擬運(yùn)用高效液相色譜法，對不同基原白芷藥材化學(xué)成分進(jìn)行分析，建立化學(xué)指紋圖譜；在此基礎(chǔ)上，建立白芷藥材中花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素9種香豆素類成分的含量測定方法，對不同批次白芷和杭白芷藥材進(jìn)行多成分含量測定；基于多成分含量測定結(jié)果，結(jié)合聚類分析、主成分分析及偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對白芷和杭白芷藥材化學(xué)進(jìn)行比較分析，尋找質(zhì)量標(biāo)志物。通過以上研究，以期分析和比較白芷和杭白芷藥材的化學(xué)成分差異，為不同基原白芷的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供分析方法和數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-2030 型高效液相色譜儀，Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm），Sartorius 型電子分析天平（德國賽多利斯）；JP-060S型超聲波清洗儀（深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司）；HH35000310 型多功能酶標(biāo)儀（德國珀金埃爾默），DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（中儀國科科技有限公司）。

1.2 材料

不同基原的白芷藥材，白芷（B1～B10）和杭白芷（H1～H10）藥材收集于河北安國、安徽亳州、四川等，藥材具體信息見表1。白芷和杭白芷藥材經(jīng)鄭玉光教授鑒定為傘形科植物白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.和杭白芷A.dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan 的干燥根。藥材標(biāo)本保存于河北中醫(yī)學(xué)院河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心。

表1 白芷和杭白芷藥材樣品信息Table 1 Sources of A. dahurica and A. dahurica var. formosana

對照品氧化前胡素（批號(hào)PS 210331-02）、白當(dāng)歸素（批號(hào)PS 011381）、歐前胡素（批號(hào)PS 010561）、水和氧化前胡內(nèi)酯（批號(hào)PS 011398）、異歐前胡素（批號(hào)PS 010956）、佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)PS 010563）、花椒毒酚（批號(hào)PS 011082）、珊瑚菜素（批號(hào)PS 000818）、白當(dāng)歸腦（批號(hào)PS 000107）、花椒毒素（批號(hào)PS 010573）購于成都普思生物科技股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相為0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B）；梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～5 min，10%～20%B；5～15 min，20%～35% B；15～30 min，35%～60% B；30～35 min，60%～70% B；體積流量0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測波長310 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素適量，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成含花椒毒酚0.85 mg/mL、水和氧化前胡內(nèi)酯1.15 mg/mL、白當(dāng)歸素1.20 mg/mL、花椒毒素1.20 mg/mL、佛手柑內(nèi)酯0.60 mg/mL、氧化前胡素4.00 mg/mL、歐前胡素2.20 mg/mL、珊瑚菜素2.55 mg/mL 和異歐前胡素2.60 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取白芷和杭白芷藥材粉末（過65 目篩）0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，80 kHz 超聲提取50 min，室溫下冷卻，補(bǔ)足減失質(zhì)量，在13 000 r/min 下離心10 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜，即得。

2.4 白芷和杭白芷化學(xué)指紋圖譜研究

為了全面分析白芷和杭白芷藥材中化學(xué)成分，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)，首先采用高效液相色譜法對10批白芷和10批杭白芷藥材化學(xué)成分進(jìn)行分析，建立其化學(xué)指紋圖譜。

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取白芷藥材B1 樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，以歐前胡素色譜峰為參照，計(jì)算指紋圖譜中 11 個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，考察所建立指紋圖譜方法的精密度。結(jié)果表明各共有峰相對保留時(shí)間的 RSD 值均小于0.1%，各共有峰峰面積的RSD 值均小于1.3%，本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白芷藥材B1 供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h 后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以歐前胡素色譜峰為參照峰，計(jì)算指紋圖譜中11 個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。各共有峰相對保留時(shí)間的RSD值均小于0.2%，各共有峰相對峰面積的RSD 值均小于1.7%。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取白芷材料B1 樣品粉末6 份，每份0.5 g，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，以歐前胡素色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果表明各共有峰相對保留時(shí)間的RSD 值均小于0.2%，各共有峰相對峰面積的RSD 值均小于2.0%，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.4.4 不同基原白芷藥材化學(xué)指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將10 批白芷和10 批杭白芷藥材，共20批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行色譜分析，將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，以B1 樣品色譜圖作為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗設(shè)為0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正后，進(jìn)行色譜峰的匹配，生成對照指紋圖譜。9 號(hào)峰（歐前胡素）穩(wěn)定性好，且峰面積較大，因此以保留時(shí)間為28.76 min 的9 號(hào)作為參照峰，最終確定了11 個(gè)共有峰。通過對照品比對，共指認(rèn)出9 個(gè)共有峰，分別為花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素。不同批次白芷和杭白芷藥材色譜圖見圖1，對照指紋圖譜見圖2。

圖1 10 批白芷和10 批杭白芷藥材化學(xué)指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprints of 10 batches of A. dahurica and 10 batches of A. dahurica var. formosana

圖2 對照指紋圖譜Fig. 2 Reference fingerprint

將10 批白芷和10 批杭白芷藥材圖譜與對照圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。由相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可知各批白芷和杭白芷藥材的相似度良好，相似度結(jié)果均大于0.930（表2），所建立的指紋圖譜方法可用于不同基原白芷藥材的整體質(zhì)量控制。

表2 藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 2 Similarity of 10 batches of A. dahurica and 10 batches of A. dahurica var. formosana

2.5 不同基原白芷藥材多成分含量測定

采用HPLC 法建立了不同基原白芷藥材的化學(xué)指紋圖譜，確定了11 個(gè)共有峰并指認(rèn)出其中9個(gè)共有峰。由白芷和杭白芷藥材指紋圖譜（圖1）可知，白芷和杭白芷藥材色譜圖較為相似，所含化學(xué)成分種類基本一致，均含有所指認(rèn)的9 個(gè)香豆素類成分；但是，白芷和杭白芷藥材各共有峰的高度上有一定差異，提示白芷和杭白芷藥材所含活性香豆素類成分的含量有差異。為了進(jìn)一步明確白芷和杭白芷藥材中香豆素類成分的具體含量，采用HPLC 法建立了白芷和杭白芷藥材多成分含量測定方法，對所指認(rèn)的9 個(gè)香豆素類成分，包括花椒毒酚（2 號(hào)峰）、水合氧化前胡內(nèi)酯（3號(hào)峰）、白當(dāng)歸素（4 號(hào)峰）、花椒毒素（5 號(hào)峰）、佛手柑內(nèi)酯（6 號(hào)峰）、氧化前胡素（8 號(hào)峰）、歐前胡素（9 號(hào)峰）、珊瑚菜素（10 號(hào)峰）和異歐前胡素（11 號(hào)峰）進(jìn)行含量測定。

2.5.1 線性關(guān)系、定量限和檢測限 將混合對照品溶液用甲醇稀釋成一系列的梯度濃度溶液后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以待測化合物峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸，得到各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線。另以適宜濃度的對照品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，分別測定各待測成分信噪比（信噪比為10 和3 時(shí)的濃度計(jì)為定量限和檢測限）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，結(jié)果表明在線性范圍內(nèi)所測定的9 種香豆素類成分的線性良好（R2＞0.999 0）。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各個(gè)成分的峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各香豆素類成分的含量，并計(jì)算含量測定結(jié)果的RSD，結(jié)果表明花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素的RSD 值分別為1.13%、1.00%、1.03%、0.99%、1.02%、1.00%、1.19%、0.99%、0.99%。

表3 9 種香豆素類成分回歸方程、相關(guān)系數(shù) (R2)、線性范圍、定量限及檢測限Table 3 Regression equations, correlation coefficients (R2), linear ranges, limit of quantification and limit of detection of the nine quantified coumarins compounds

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白芷藥材B1 供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h 后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各香豆素類成分的含量，并計(jì)算含量測定結(jié)果的RSD，考察方法穩(wěn)定性。結(jié)果表明花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素的RSD 值分別為1.25%、0.37%、0.47%、0.48%、0.24%、0.48%、0.40%、0.38%、1.84%，表明供試品溶液在24 h 之內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取白芷B1 樣品粉末6份，每份0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各香豆素類成分的含量，并計(jì)算含量測定結(jié)果的RSD，考察重復(fù)性。結(jié)果顯示花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素的RSD 值分別為0.45%、0.37%、0.41%、0.30%、0.19%、0.25%、0.17%、0.16%、2.11%，表明所建方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取白芷B1 樣品粉末6 份，每份0.25 g，分別加入9 種香豆素類成分對照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄各化學(xué)成分的峰面積，計(jì)算各成分的含量。加樣回收率考察結(jié)果顯示花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素的平均加樣回收率分別為101.69%、98.25%、99.56%、102.11%、104.47%、101.79%、100.47%、101.97%、102.79%，RSD 值分別為1.43%、1.38%、0.81%、0.81%、1.47%、1.54%、2.73%、1.43%、1.34%，表明所建立的含量測定方法準(zhǔn)確性良好。

2.5.6 樣品含量測定 按照“2.3”項(xiàng)下方法制備10 批白芷（B1～B10）和10 批杭白芷（H1～H10）樣品供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分別測定花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素的含量。白芷、杭白芷藥材和混合對照品的HPLC 如圖3 所示，白芷和杭白芷藥材多成分含量測定結(jié)果見表4 和圖4。

圖3 白芷 (A)、杭白芷 (B) 和混合對照品 (C) 色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of A. dahurica (A) and A.dahurica var. formosana (B) and mixed standards solution(C)

表4 白芷和杭白芷藥材中9 種香豆素類成分含量測定結(jié)果（n＝3）Table 4 Contents of nine coumarins compounds in A. dahurica and A. dahurica var. formosana samples (n = 3)

圖4 白芷和杭白芷藥材中9 種香豆素類成分的含量Fig. 4 Contents of nine coumarins compounds in A.dahurica and A. dahurica var. formosana samples

由測定結(jié)果可知，白芷和杭白芷藥材樣品中均含有所測定的9 種香豆素類成分。所測定的9 種香豆素類成分中，歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在白芷和杭白芷藥材中均最高，分別為4 330.59～7 312.96 μg/g和3 036.99～4 544.95 μg/g；而白芷和杭白芷藥材中花椒毒酚的量最低，分別為73.95～205.48 μg/g 和15.45～54.97 μg/g。進(jìn)一步計(jì)算了白芷和杭白芷藥材中9種香豆素的總量，結(jié)果表明二者之間存在明顯差異，白芷藥材（11 015.96～14 763.42 μg/g）的香豆素類成分的總量顯著高于杭白芷藥材（6 019.81～8 888.73 μg/g）。

2.6 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的不同基原白芷藥材分析與比較

為了進(jìn)一步對白芷和杭白芷兩個(gè)不同基原白芷藥材進(jìn)行比較，明確二者之間的差異，尋找質(zhì)量標(biāo)志物，在多成分定量分析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用層聚類分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，以所測定的9 種香豆素類成分的含量作為變量，對白芷和杭白芷藥材進(jìn)行分析與比較。

2.6.1 聚類分析 聚類分析是一種常見的無監(jiān)督的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，是按“物以類聚”原則研究事物分類的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，可將相似程度較大的樣品聚合為一類，該方法被廣泛用于中藥的區(qū)分與鑒別中[10]。為比較白芷和杭白芷2 個(gè)不同基原白芷藥材之間的差異，以白芷及杭白芷藥材的9 個(gè)香豆素類成分含量測定結(jié)果為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0 軟件，采用組間連接，分類依據(jù)為平方歐氏距離，對白芷和杭白芷樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖5。由聚類分析結(jié)果可得，20 批樣品主要聚為2 大類，白芷藥材（B1～B10）為一類，杭白芷藥材（H1～H10）為另一類，提示白芷和杭白芷藥材化學(xué)成分之間有差異，白芷藥材化學(xué)成分含量與其基原因素有關(guān)。

圖5 白芷和杭白芷藥材聚類分析樹狀圖Fig. 5 Dendrogram of cluster analysis of A. dahurica and A.dahurica var. formosana samples

2.6.2 主成分分析 主成分分析是一種非監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，可將多變量數(shù)據(jù)集可視化，在不丟失太多信息的基礎(chǔ)上，通過線性變換，將原始眾多相關(guān)性的指標(biāo)重新組合成新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)（主成分）來代替原始指標(biāo)充分反映原始數(shù)據(jù)的信息，可用于對藥材的區(qū)分與鑒別[11]。為了進(jìn)一步比較白芷和杭白芷藥材之間的差異，采用用SIMCA 14.1 軟件，以測得的9 個(gè)香豆素類成分含量測得結(jié)果為變量，建立主成分分析模型，繪制主成分分析得分圖。由主成分分析結(jié)果可知，前2 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為84.24%，其中第1 主成分貢獻(xiàn)率為 57.69%，第 2 主成分貢獻(xiàn)率為26.55%。從所得的方差貢獻(xiàn)率來看，建立的模型累計(jì)解釋能力參數(shù)R2X和預(yù)測能力參數(shù)Q2分別為0.913 和0.651，說明所建立的主成分分析模型的區(qū)分度和預(yù)測程度都較好，前2 個(gè)主成分已基本能反映出不同基原白芷樣品的主要特征。以前2個(gè)主成分建立坐標(biāo)系，得到20 批白芷和杭白芷樣品的主成分分析得分圖（圖6），由主成分分析結(jié)果可知，白芷（B1～B10）和杭白芷（H1～H10）樣品明顯分別集中于2 個(gè)區(qū)域，結(jié)果與聚類分析分類結(jié)果一致，提示不同基原白芷藥材在化學(xué)成分含量上存在明顯的差異性。

圖6 白芷和杭白芷藥材主成分分析得分圖Fig. 6 Principal component analysis scores plot of A.dahurica and A. dahurica var. formosana samples

2.6.3 偏最小二乘判別分析 為了進(jìn)一步區(qū)分與比較白芷和杭白芷藥材，尋找二者之間的差異標(biāo)志物，在進(jìn)行了無監(jiān)督的主成分分析基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析，最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異[12]。采用SIMAC 14.1軟件，以9 個(gè)香豆素類成分的含量測定結(jié)果，建立偏最小二乘判別分析模型，偏最小二乘判別分析得分圖見圖7。建立的模型的累計(jì)解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.887、0.921，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.859，說明模型穩(wěn)定且具有良好的預(yù)測準(zhǔn)確性。20批白芷和杭白芷樣品可分為2 類，B1～B10 為白芷樣品分布趨勢較為集中，聚為一組，H1～H10 為杭白芷樣品分布趨勢較為集中，聚為一組。不同基原的白芷藥材，分布在中線2 側(cè)，偏最小二乘判別分析與聚類分析及主成分分析結(jié)果一致。

圖7 白芷和杭白芷藥材偏最小二乘判別分析得分圖Fig. 7 Partial least squares discriminant analysis scores plot of A. dahurica and A. dahurica var. formosana samples

進(jìn)一步根據(jù)模型中各化學(xué)成分在S-plot 圖中的分布和變量權(quán)重重要性排序（variable importance in projection，VIP）預(yù)測值來篩選差異性化合物，9種香豆素類成分的S-plot 圖及VIP 值如圖8 所示。一般認(rèn)為在95%的置信區(qū)間內(nèi)，VIP＞1.0 的化合物在兩組分類中貢獻(xiàn)比較大。由偏最小二乘判別分析的S-plot 圖和VIP 值可知，佛手柑內(nèi)酯、珊瑚菜素、異歐前胡素、氧化前胡素和花椒毒素的VIP 值均大于1，對區(qū)分白芷和杭白芷藥材發(fā)揮著重要作用。由含量測定結(jié)果可知（圖9），白芷藥材中佛手柑內(nèi)酯、珊瑚菜素、異歐前胡素、氧化前胡素和花椒毒素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（303.71±34.55）、（1 522.95±222.32）、（1 017.18±128.26）、（4 144.20±2 069.26）、（113.53±40.17）μg/g，明顯高于杭白芷藥材中佛手柑內(nèi)酯（141.00±27.97）μg/g、珊瑚菜素（952.60±81.68）μg/g、異歐前胡素（633.04±76.98）μg/g、氧化前胡素（1 283.87±169.11）μg/g 和花椒毒素（35.47±11.93）μg/g 的平均含量（P＜0.001），這5 個(gè)香豆素類成分可以認(rèn)為是白芷藥材和杭白芷藥材的差異性化合物。

圖8 基于偏最小二乘判別分析白芷和杭白芷藥材的S-plot圖和VIP 圖Fig. 8 S-polt and VIP diagrams of A. dahurica and A.dahurica var. formosana samples based on partial least squares discriminant analysis

圖9 白芷和杭白芷藥材中佛手柑內(nèi)酯、珊瑚菜素、異歐前胡素、氧化前胡素和花椒毒素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 9 Average contents of bergapten, phellopterin, isoimperatorin, oxypeucedanin and xanthotoxin in A. dahurica and A.dahurica var. formosana samples

3 討論

為了研究和比較不同基原白芷藥材（白芷和杭白芷）化學(xué)成分，首先采用高效液相色譜法對白芷和杭白芷藥材進(jìn)行了指紋圖譜分析及多成分含量測定研究。在分析之前，對高效液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用二極管陣列檢測器對白芷和杭白芷藥材樣品在210～400 nm 進(jìn)行全波段掃描，選擇310 nm作為指紋圖譜及含量測定的檢測波長。進(jìn)一步比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液等為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)色譜基線平直，靈敏度高，分離效果最佳。另外，對白芷和杭白芷藥材的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，以9 個(gè)香豆素類成分總含量為優(yōu)化指標(biāo)，分別比較了不同提取溶劑（100%、90%、80%、70%、60%甲醇）、不同超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）和不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）的提取效果，結(jié)果表明在料液比為1∶30，超聲時(shí)間50 min，80%甲醇為提取溶劑的條件下對白芷和杭白芷藥材中香豆素類成分提取率最高。

香豆素類成分為白芷藥材的主要活性成分，但《中國藥典》2020 年版中僅以歐前胡素和異歐前胡素2 種香豆素類成分作為白芷藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，不能全面反映白芷藥材的質(zhì)量及白芷和杭白芷的質(zhì)量差異[1]。因此，需要建立更加全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，對不同基原白芷和杭白芷藥材進(jìn)行分析與比較。本研究采用所建立的高效液相色譜法分析了10 批白芷及10 批杭白芷藥材樣品，建立了不同基原白芷藥材的化學(xué)指紋圖譜，各批次樣品與對照指紋圖譜相似度較高，均在0.930 以上。由指紋圖譜分析可知2 個(gè)不同基藥材白芷和杭白芷所含化學(xué)成分種類一致，但峰面積大小有差異，提示兩者成分含量之間存在一定差異性。為了更好地鑒別和區(qū)分白芷和杭白芷藥材，在指紋圖譜分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定了白芷和杭白芷藥材中花椒毒酚、水合氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素和異歐前胡素9種香豆素類成分的含量。所測定的9 個(gè)香豆素類成分中以歐前胡素的含量最高。對比白芷和杭白芷藥材中香豆素類成分含量發(fā)現(xiàn)，白芷藥材中香豆素類成分總含量明顯高于杭白芷藥材。

為了進(jìn)一步區(qū)分白芷和杭白芷藥材，尋找質(zhì)量標(biāo)志物，在含量測定的基礎(chǔ)上，采用聚類分析、主成分分析及偏最小二乘判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對白芷與杭白芷藥材進(jìn)行了區(qū)分與比較。結(jié)果表明，基于9 種香豆素類成分的定量結(jié)果，可以將不同基原白芷藥材區(qū)分開來。由9 種香豆素類成分在S-plot圖中的分布和VIP 值可知（圖8），佛手柑內(nèi)酯、珊瑚菜素、異歐前胡素、氧化前胡素和花椒毒素5 個(gè)香豆素類成分為白芷和杭白芷藥材之間的差異性化合物。所篩選得到的5 個(gè)差異化合物在白芷藥材中的含量明顯高于杭白芷藥材（圖9），可以作為白芷藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，也可作為區(qū)分和鑒別白芷和杭白芷藥材的指標(biāo)性化合物。

本研究采用HPLC法對白芷及杭白芷藥材化學(xué)成分進(jìn)行了分析，建立了白芷和杭白芷藥材化學(xué)指紋圖譜和多成分含量測定方法；在此基礎(chǔ)上，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對白芷和杭白芷藥材進(jìn)行了區(qū)分與比較。所建立的分析方法簡便、準(zhǔn)確，有助于更好地了解白芷藥材2 個(gè)基原白芷與杭白芷之間的香豆素類成分化學(xué)含量差異，為不同基原白芷藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)與控制提供了方法保障和數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突