廣豐千金薯煙草花葉病毒lncRNA 測序鑒定、原核蛋白表達及其序列分析4

尹明華，張艷紅，李淑娟，段 俊，蔣曉峰

1. 上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001

2. 上饒農業技術創新研究院，江西 上饒 334001

3. 上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室，江西 上饒 334001

4. 上饒市薯芋類作物種質保存與利用重點實驗室，江西 上饒 334001

廣豐千金薯DioscoreapolystachyaTurczaninow.cv. Guangfeng Qianjin 為薯蕷科薯蕷屬多年生草本植物，原產于江西省上饒市廣豐區少陽鄉，為上饒市地方特色山藥品種[1]。廣豐千金薯肉質根狀莖可菜藥兼用，菜用綿密粉嫩、軟糯爽口，藥用可健脾養胃、滋腎益精、預防心血管病、增強免疫力、延緩衰老，是老少皆宜的滋補佳品，經濟價值高，產品遠銷到東南亞和日本等國，深受消費者青睞[2]。在生產中，廣豐千金薯由于長期采用營養繁殖，病毒感染嚴重，造成種性退化、產量下降、品質變劣、薯塊變小、畸形、賣相差，農民收入受損[3]。因此，開展健康種苗研究，采用生物技術的方法脫除病毒，提純復壯，提高產量，改善品質已成為廣豐千金薯生產中亟待解決的問題。而脫除病毒的前提是需要鑒定廣豐千金薯的病毒種類及其病毒基因序列信息。廣豐千金薯的病毒種類及其基因序列信息一旦探明，即可利用分子生物學的手段去廣豐千金薯試管苗脫毒效果進行快速鑒定。目前，對廣豐千金薯的研究僅限于高產栽培[3]、微型塊莖萌發[4]、離體快繁[2]、干旱脅迫[1]、遺傳穩定性[5]、光合生理[6]等方面，但廣豐千金薯病毒種類及其蛋白原核表達和基因序列分析方面的研究尚無報道。本實驗通擬過lncRNA 測序鑒定廣豐千金薯病毒種類及其相關基因，利用大腸桿菌重組技術表達廣豐千金薯病毒蛋白，并采用生物信息學方法對其進行序列分析，旨在為廣豐千金薯脫毒苗的培育和鑒定提供理論依據和技術基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

樣品采自江西省上饒市廣信區少陽鄉，由上饒師范學院王艾平教授鑒定為千金薯D.polystachyaTurczaninow. cv. Guangfeng Qianjin 試管苗。

1.2 儀器

Illumina Hiseq 4000 測序系統（美國Illumina公司）、DK-S22 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）、GL-21M 型高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、LX-B150L 型不銹鋼立式滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）、SW-CJ-1FD 型超凈工作臺（蘇凈安泰有限公司）、ZQLY-180 型恒溫搖床（上海知楚有限公司）、JY 92-IIN 型超聲破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、DW-86L626 型超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）、蛋白純化儀（美國Bio-rad公司，NGC Quest? 10 Plus）、DYCZ-24DH 型SDS-PAGE 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Qubit 3.0 型核酸蛋白定量儀（美國Life 公司-美國生命技術公司）。

2 方法

2.1 廣豐千金薯煙草花葉病毒種類及其蛋白基因的確定

2.1.1 RNA 提取 從江西鉛山紅芽芋試管苗植株上各采集100 mg 左右幼嫩葉組織，混合后提取小RNA。

2.1.2 RNA 質檢 完成RNA 抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質量。

2.1.3 RNA 片段化 采取約400～500 bp 樣品放入Covaris M220 儀器中進行反轉錄。

2.1.4 文庫構建 cDNA 片段末端補平，加A，加測序接頭；瓊脂糖凝膠電泳進行片段篩選，將目標區域的片段回收；通過PCR 擴增篩選未加上接頭的片段；PCR 產物純化，質檢。試劑為TruSeq? DNA Sample Prep Kit。

2.1.5 橋式PCR DNA 片段的一端與芯片上引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近的另一種引物互補，也被固定住，形成“橋（bridge）”；PCR 擴增，產生DNA 簇；線性化成為單鏈。試劑為Hiseq PE Cluster Kit v4 cBot。

2.1.6 Illumina Hiseq 4000 測序 加入改造過的DNA 聚合酶和帶有4 種熒光標記的dNTP，每次循環只摻入單種堿基；用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第1 輪反應所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3’端黏性，繼續聚合第2 個核苷酸；統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA 片段的序列。

利用SOAPdenovo v2.04（http://soap.genomics.org.cn/）拼接軟件對質控后的全部clean data 進行denovo 初步組裝，將組裝得到的全部contig 與病毒數據庫進行比對，篩選得到來自病毒的contig；然后利用MITObim v1.6 通過迭代比對，將測序的所有clean reads mapping 到這些contig 上進行延伸，通過gap close 獲得病毒的全基因組序列。

利用DOGMA 軟件（http://dogma.ccbb.utexas.edu/）對基因組中包含的gene 進行預測。將預測基因的蛋白序列與Nr 數據庫進行blastp 比對（BLAST 2.2.28+），初步判斷廣豐千金薯的病毒種類及其相關基因。

2.2 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白基因的生物信息學分析

使用BioEdit 軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用ProtParam 預測酶的理化性質，用ProtScale 預測酶的疏/親水性。使用GOR I 軟件在線預測酶的二級結構。使用SWISS-MOLD 在線預測酶的三級結構。采用WoLFPsort 在線預測基因的表達部位。通過軟件DNAMAN 和Bioedit 進行氨基酸序列比對，利用MEGA5.0 軟件進行系統進化樹的構建。

2.3 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白的大腸桿菌重組表達

2.3.1 感受態轉化及陽性克隆篩選 從超低溫冰箱中取出BL21（DE3）感受態細胞，置于冰上融化；加入質粒（pET-28a，5 μg），輕輕吹吸充分混勻，冰上放置30 min；水浴鍋42 ℃熱擊90 s，冰上放置1 min；加入800 μL 預熱LB 液體培養基，37 ℃158 r/min 培養50 min；6000 r/min 離心4 min，去部分上清（800 μL 體積），剩余菌液混勻后涂至氨芐抗性平板上；倒置平板，37 ℃培養 12～16 h 可見出現菌落（陽性克隆）。

2.3.2 陽性克隆小量表達與鑒定 挑選含重組質粒的單菌落至3 mL LB 液體培養基（氨芐抗性）中，37 ℃培養過夜后-20 ℃保種；分別挑選含重組質粒的單菌落至3 mL LB 液體培養基（氨芐抗性）中，37 ℃震蕩培養至A600約0.6；取部分菌液作為對照組，余下菌液加入IPTG 誘導劑（終濃度0.1 mmol/L），16 ℃震蕩培養12 h；分別取2 組菌液0.15 mL，12 000×g離心2 min，菌體沉淀以 40 μL 1×loading buffer 重懸裂解，SDS-PAGE 檢測。

2.3.3 蛋白大量表達及破菌檢測 取保存于-20 ℃的菌種100 μL 接種于100 mL LB 液體培養基（氨芐抗性）中震蕩培養過夜；取100 mL 菌液接種于 2000 mL LB 液體培養基中，37 ℃擴大培養至A600約0.6，降低培養溫度到30 ℃；加入IPTG誘導劑至終濃度0.1 mmol/L，16 ℃繼續震蕩培養12 h；8000 r/min 離心3 min 收集菌體，重懸于50 mL預冷NTA-0 緩沖液中，冰浴30 min；超聲破碎菌體，參數設置為功率200 W、工作3 s、暫停4 s、99 個循環；16 000 r/min，4 ℃離心50 min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀進行SDS-PAGE 檢測，剩余上清及沉淀至于4 ℃備用。

3 結果與分析

3.1 測序數據統計

對經過質量剪切前后的數據分別進行測序總堿基數、文庫平均插入長度、Q20、Q30、平均測序深度統計，結果見表1。由表1 可知，建立的文庫準確率很高。

表1 測序數據統計Table 1 Sequencing data statistics

3.2 基因組組裝

利用SOAPdenovo v2.04 拼接軟件對質控后的全部clean data 進行denovo 初步組裝，將組裝得到的全部contig 與病毒數據庫進行比對，篩選得到來自病毒的contig；然后利用MITObim v1.6 通過迭代比對，將測序的所有clean reads mapping 到這些contig 上進行延伸，通過gap close 獲得病毒的全基因組序列，最終組裝結果的統計，廣豐千金薯病毒種類是1 個，該病毒的總長度為6395 bp，其GC 含量為43.35%。

3.3 Gene 查找

利用DOGMA 軟件對基因組中包含的gene進行預測，然后在進行人工矯正。gene 預測結果的統計可知，基因數量為6 個，基因總長度為6264 bp，基因平均長度為1043，基因間區GC 含量為44.65%。

3.4 基因功能注釋

將預測基因的蛋白序列與Nr 數據庫進行blastp比對（BLAST 2.2.28+），從而獲得預測基因的注釋信息。注釋結果如表2 所示。由表2 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白基因包括復制酶1（replicase，ORF1）、復制酶2（ORF2）、RNA 聚合酶（RNA polymerase）、運動蛋白（movement protein，MP）、帶電蛋白（charged protei）和外殼蛋白（coat protein，CP）。

表2 基因功能注釋結果Table 2 Gene function annotation results

3.5 廣豐千金薯煙草花葉病毒基因cDNA 序列

廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 基因cDNA 總長度和（G+C）含量見表3。廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 基因序列結果已經上傳至GenBank 數據庫，基因登陸號為OL944011。

表3 廣豐千金薯煙草花葉病毒基因cDNA 序列Table 3 cDNA sequence of tobacco mosaic virus gene from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.6 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白氨基酸序列

Protparam 預測顯示廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2氨基酸序列分析見表4。由表4 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 分別由159、268、474、40、1613 和1114 個氨基酸組成，相對分子質量分別為17 649.81、29 981.75、54 573.87、4 845.84、183 048.95 和125 860.14，等電點分別為5.09、8.90、6.83、11.89、6.57、6.53。

表4 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白氨基酸序列Table 4 Amino acid sequence of tobacco mosaic virus protein from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.7 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白親疏水性分析

經ProtScale 軟件分析，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白除ORF5 為疏水性蛋白質外，其余如ORF6、ORF4、ORF3、ORF1 和ORF2 均為親水性蛋白質。

3.8 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白二級結構分析

通過GOR 軟件預測，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白二級結構分析見表5。由表5 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF5 二級結構由β-片層和無規則卷曲構成，ORF6、ORF4、ORF3、ORF1 和ORF2 的二級結構均由α 螺旋、β-片層、無規則卷曲構成。

表5 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白二級結構Table 5 Secondary structures of tobacco mosaic virus proteins from D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.9 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白三級結構分析

SWISS-MODEL 預測顯示廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2三級結構均為單體（圖1）。

圖1 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白三級結構Fig. 1 Tertiary structure of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.10 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白亞細胞定位

采用WoLFPsort 在線軟件對廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2基因的表達部位進行預測，結果表明，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5和ORF6 分別定位于內質網、細胞核、細胞質、細胞核、線粒體、葉綠體中。

3.11 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白系統進化分析

從構建的進化樹（圖2）中可見，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6 與煙草花葉病毒CP 在一個分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6 在進化上與煙草花葉病毒CP 的親緣關系較近，同源性為99.79%；廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF4 與煙草花葉病毒MP 在一個分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF4 在進化上與煙草花葉病毒MP 的親緣關系較近，同源性為99.38%；廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF3 與煙草花葉病毒RNA 聚合酶在一個分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒RNA 聚合酶（ORF3）在進化上與煙草花葉病毒 RNA 聚合酶的親緣關系較近，同源性為99.23%；廣豐千金薯煙草花葉病毒帶電蛋白（ORF5）與煙草花葉病毒帶電蛋白在一個分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒帶電蛋白（ORF5）在進化上與煙草花葉病毒帶電蛋白的親緣關系較近，同源性為100%。廣豐千金薯煙草花葉病毒復制酶（ORF1）與煙草花葉病毒復制酶在一個分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒復制酶（ORF1）在進化上與煙草花葉病毒復制酶的親緣關系較近，同源性為99.38%。廣豐千金薯煙草花葉病毒復制酶（ORF2）與煙草花葉病毒復制酶在一個分支下，這說明廣豐千金薯煙草花葉病毒復制酶（ORF2）在進化上與煙草花葉病毒復制酶的親緣關系較近，同源性為99.49%。

圖2 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白系統進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.12 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白的序列比對信息

廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 同源蛋白的序列比對信息見圖3。圖3 中“*”號區域是該蛋白家族的保守結構域。從圖3 可知，廣豐千金薯煙草花葉病毒ORF6、ORF4、ORF3、ORF5、ORF1 和ORF2 的序列與煙草花葉病毒相似，同源性均在99.49%以上，因此，可以利用煙草花葉病毒基因序列來進行廣豐千金薯煙草花葉病毒的種類鑒別。

圖3 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白氨基酸序列的同源性比較Fig. 3 Homology comparison of amino acid sequences of proteins of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

3.13 廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白的大腸桿菌重組表達

轉化BL21（DE3）感受態細胞，挑選AMP 抗性平板上長出的陽性斑進行擴大培養與表達純化，結果見圖4。由圖4 可知，除了ORF5 蛋白太小（485 000）無法正常表達外，其他5 個蛋白（ORF1、ORF2、ORF3、ORF4 和ORF6）都成功表達，蛋白大小分別為183 050、125 860、54 570、29 980 和17 650。這說明，廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白基因的lncRNA 測序結果是準確的。

圖4 廣豐千金薯煙草花葉病毒的蛋白表達Fig. 4 Protein expression of tobacco mosaic virus in D. polystachya Guangfeng Qianjin

4 討論

目前報道的山藥病毒病害主要為山藥花葉病毒病，生長初期為害癥狀不明顯，到生長中后期癥狀嚴重，葉上出現褪綠斑，隨后綠色花斑隆起，呈斑駁花葉、凸凹卷曲畸形、黃化或壞死，嚴重時整株矮化，生長緩慢，地下莖縮小，畸形，產量下降[7]。鄢明峰等[8]發現日本山藥花葉病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）為瑞昌山藥花葉型病毒的病毒原，江西瑞昌、廣西和日本共32 個JYMV 分離物按其地域來源形成了3 個獨立的進化組群，表明JYMV 的進化與其地理來源具有明顯的相關性。張蕾等[9]和Zou 等[10]均利用RT-PCR 手段檢測到淮山藥感染山藥溫和花葉病毒（Yam mild mosaic virus，YMMV）。Silva 等[11]利用RT-PCR 技術確定西非山藥的主要危害病毒為山藥花葉病毒。在本試驗中，通過lncRNA 測序鑒定廣豐千金薯煙草花葉病毒基因，并利用大腸桿菌重組技術成功表達了廣豐千金薯煙草花葉病毒蛋白，第1 次確定了廣豐千金薯的主要危害病毒為煙草花葉病毒。

研究表明，山藥花葉病毒（yam mosaic virus，YMV）是一種具有大約785 nm 長的彎曲絲狀顆粒，由一種單鏈RNA 和一種外殼蛋白組成，很難傳播到小范圍的宿主，由蚜蟲以非持久性方式傳播，在熱帶地區的山藥種植中造成了重要的經濟損失[12]。YMV 基因組RNA 長度為9608 個核苷酸，包含編碼3103 個氨基酸（aa）多蛋白的一個開放閱讀框（open reading frame，ORF）[13]，具有馬鈴薯Y 病毒屬特征，是馬鈴薯Y 病毒屬的一個獨特成員[14]。史躍偉等[15]通過RT-PCR 的方法獲得了貴州煙草花葉病毒CP基因，該基因全長為507 bp，并利用原核表達技術表達了貴州煙草花葉病毒CP 蛋白，為后期單克隆抗體的制備奠定了基礎。煙草花葉病毒南瓜分離物CP基因與GenBank 上其他TMV 分離物CP基因核苷酸序列的同源性為86.5%～99.0%，推導的氨基酸序列同源性為93.7%～99.4%，煙草花葉病毒南瓜分離物CP基因與原核表達載體pET-22b（+）連接，在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS 誘導表達出相對分子質量約20 000 的融合蛋白[15]。云南5個不同地區煙草花葉病毒CP基因均為480 個堿基，編碼 159 個氨基酸，與TMV-U1、P、B 株和福建分離物有較高的同源率（90%以上），而與TMV 中國株系的同源率較低（70%～80%），與TMV 中國株應屬于同種病毒不同的株系[16]。李凡等[17]的研究結果也證實了這一觀點，再次確認煙草花葉病毒云南分離物CP基因為480 個堿基，編碼159 個氨基酸，并指出煙草花葉病毒云南分離物CP基因與T MV-U1 株系和TMV 韓國普通株系核苷酸同源性均為100%。但也有研究表明，云南煙草花葉病毒CP基因含477 個核苷酸，編碼159 個氨基酸[18]。本實驗結果也表明，廣豐千金薯煙草花葉病毒CP基因cDNA 總長度為480 bp，編碼159 個氨基酸組成，與煙草花葉病毒CP基因親緣關系較近。

煙草花葉病毒的致病性是由CP基因及3’端非編碼區以外的基因（如MP基因、復制酶基因等）決定的。煙草花葉病毒MP基因決定植物病毒在寄主植物細胞間的移動從而可決定病毒對寄主的侵染性。有研究表明，煙草花葉病毒蠶豆分離MP基因由807 個核苷酸組成，編碼268 個氛基酸，煙草花葉病毒的MP基因在不同株系中非常保守，同源性極高[19]。王得元等[20]對廣東煙草花葉病毒MP基因進行PCR 擴增，獲得了一條0.8 kb的特異擴增產物，與已發表的TMVMP基因編碼區803 bp 大小相近。余曉紅等[21]克隆了煙草花葉病毒MP基因，發現MP基因含有1 個507 bp 的閱讀框架，編碼268 個氨基酸，與國外發表的TMVU1 株運動蛋白基因cDNA 的核昔酸序列及推導的氨基酸序列相比，同源率均高達98 以上，再次表明煙草花葉病毒MP基因在同一病毒的不同株系中是相當保守的。本實驗結果表明，廣豐千金薯煙草花葉病毒MP基因的cDNA 總長度為807 bp，編碼268 個氨基酸，與煙草花葉病毒MP基因親緣關系較近。

因此，廣豐千金薯煙草花葉病毒與煙草花葉病毒的親緣關系較近，同源性在99%以上。表明廣豐千金薯煙草花葉病毒不屬于馬鈴薯Y 病毒屬，與煙草花葉病毒同源性極高，氨基酸序列及核酸序列與煙草花葉病毒其他植物分離物相似度高，在進化上高度保守。因此，可以利用煙草花葉病毒基因序列來進行廣豐千金薯煙草花葉病毒的種類鑒別。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突